PCR结合寡核苷酸分子杂交技术在基因诊断中的应用——附一例β地贫(IVS—Ⅰ—5G→C)杂合子的报告

本文报告采用^(32)P标记的寡核苷酸探针与聚合酶链式反应(PCR)扩增的β珠蛋白基因的特异DNA片段进行分子杂交,鉴定β地中海贫血(地贫)的基因突变,检出1例病人为地贫基因突变(IVS-1-5G→C)的杂合子,为临床开展其它遗传病及病毒、肿瘤等疾病的基因诊断提供了实用、有效的途径.

山核桃寡核苷酸探针开发及其应用

【目的】利用山核桃全基因组测序数据,为山核桃开发一些寡核苷酸类型的染色体物理标记,并建立起山核桃寡核苷酸探针开发方法,以期为其他山核桃品种相关研究提供参考。【方法】以山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大别山山核桃、贵州山核桃、薄壳山核桃及喙核桃为材料,利用Tandem Repeat Finder软件分析山核桃基因组中的重复序列,按照Period size>4,Copy number>100,且Period size*Copy number>3000的筛选条件对重复序列进行筛选,根据筛选结果合成了约60条寡核苷酸探针,利用荧光原位杂交技术对这些探针进行筛选。【结果】1)sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-5S及sht-45S均可在山核桃染色体上产生相应的荧光信号,且sht-2、sht-3、sht-4及sht-5在山核桃染色体上的分布模式相同,有2对强弱不同的信号存在,sht-45S在山核桃染色体上有1对信号存在,sht-5S仅在山核桃单条染色体上有1个信号位点分布,这些探针均位于染色体的近着丝粒区域。2)sht-5的2对信号位点中,其中较强的1对位点与sht-45S的信号位点在山核桃染色体上分布位置完全重叠。3)45SrDNA与sht-45S在山核桃染色体上分布位置完全重叠,5SrDNA与sht-5S在山核桃染色体上的分布位置也完全重叠。4)sht-5在湖南山核桃、云南山核桃、大别山山核桃及贵州山核桃染色体上均有信号分布,且与山核桃分布模式相似,但sht-5在喙核桃及薄壳山核桃染色体上没有信号。5)sht-5S及sht-45S在湖南山核桃、云南山核桃、大别山山核桃、贵州山核桃及薄壳山核桃染色体上均有信号分布,但在喙核桃染色体上没有信号分布。6)sht-45S在湖南山核桃、大别山山核桃及贵州山核桃染色体上的分布模式相似,均只有1对位点存在,sht-45S在薄壳山核桃染色体上有2对位点存在,位于2对同源染色体的近着丝粒区域。7)sht-5S在云南山核桃、贵州山核桃、大别山山核桃及薄壳山核桃4个山核桃种染色体上的分布模式相似,均只有1对信号位点存在,位于1对同源染色体上的近着丝粒区域,在湖南山核桃染色体上有2种不同的分布模式,第一种分布模式具有1个单独的信号位点,第二种分布模式中,具有2个强弱不同的荧光信号,均位于染色体的近着丝粒区域。【结论】1)sht-2/3/4/5、sht-5S及sht-45S可作为分析山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大别山山核桃及贵州山核桃染色体的物理标记。2)sht-5S及sht-45S可代替质粒45SrDNA和5SrDNA,用来对山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大别山山核桃、薄壳山核桃及贵州山核桃染色体进行分析。

花生栽培种和野生种Arachissp.30119六倍体杂种的创制与鉴定

【目的】花生野生种包含许多优异的抗病虫基因,是栽培种改良的重要基因资源库,将野生种染色质导入栽培种是花生远缘杂交研究的重要目的。野生种A.sp.30119对多种花生病害具有抗性,研究其与栽培种的杂种后代,为明确A.sp.30119的身份和未来能够利用其优异抗性提供依据。【方法】利用异源四倍体花生栽培品种白突131与二倍体野生种A.sp.30119杂交,通过胚拯救获得种间杂种F1(W1212),但F1不结实。为了揭示W1212不结实的原因并获得可育的后代,先利用根尖细胞有丝分裂中期和花粉母细胞染色体制片,观察其染色体数目和减数分裂染色体联会情况,再利用试管苗染色体加倍方法对W1212进行加倍处理,最终收获4个单粒荚果,将其中一个荚果的种子组织培养成完整植株并命名为Am1212。利用顺序GISH/FISH和SSR标记分析Am1212的染色体组成,并观察调查其表型特征。最后,利用rDNA FISH随机分析8个Am1212的F3代植株的有丝分裂中期染色体数目,评价其染色体遗传稳定性。【结果】白突131与A.sp.30119的杂种一代W1212花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的染色体平均构型为1Ⅲ+6Ⅱ+15Ⅰ,其染色体不能正常配对,表现为高度不育,染色体加倍处理后W1212下针枝条的花粉育性显著提高。白突131、A.sp.30119和Am1212的顺序GISH/FISH分析结果表明,A.sp.30119可能为A基因组二倍体野生种。Am1212有60条染色体,包含白突131与A.sp.30119的全部染色体,证实其为六倍体杂种后代。但Am1212自交F3代有37.5%的植株发生了染色体数目变异。通过分子标记筛选和表型调查,获得17个特异追踪A.sp.30119的显性和共显性标记,明确了Am1212的遗传特性。【结论】创制了一个新的六倍体花生Am1212,该六倍体整合了野生种染色质,同时,Am1212也拥有了小荚果等不利性状,且染色体遗传稳定性较差,因此,未来育种利用过程中,需要结合精准的染色体鉴定技术,打破不良连锁,获得具有补偿效应且包含有利性状的染色体变异材料。

纤溶酶原激活物抑制剂活性及其4G/5G基因多态性与急性冠状动脉综合征发病的关系

目的了解急性冠状动脉综合征患者血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性变化及其启动子4G/5G基因多态性特点,以探讨血浆纤溶酶原激活物抑制剂1及其基因多态性在急性冠状动脉综合征发病过程中的作用。方法对106例急性冠状动脉综合征患者9、8例稳定型冠心病患者和60例对照者用聚丙烯酰胺凝胶电泳寡核苷酸杂交分析法测定白细胞启动子4G/5G多态性位点的基因型,用酶联免疫吸附法测定血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性。结果急性冠状动脉综合征组血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性(18.0±2.9 kAU/L)较稳定型冠心病组(16.8±2.7 kAU/L)和对照组(16.2±2.8 kAU/L)增高(P<0.01和P<0.005);急性冠状动脉综合征组中4G/4G纯合子个体(49.1%)较稳定型冠心病组(28.6%)和对照组(26.7%)频率高(P<0.05);4G/4G纯合子个体的血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性最高,5G/5G个体最少(P<0.05)。结论血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性与启动子4G/5G基因型有关;血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性增高是急性冠状动脉综合征发病的危险因素之一。

水稻染色体双链寡核苷酸荧光原位杂交技术

染色体制备与识别技术是遗传学研究的重要手段,而寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-FISH)是近年来兴起的染色体识别技术。灵活高效的探针是荧光原位杂交过程中的关键因素。传统的单链寡核苷酸探针标记过程复杂,且获得单个探针的成本较高。在单链寡核苷酸探针的基础上进行改良,利用靶向全染色体(片段)的特异性引物进行扩增,将获得产物纯化,即可得到目的探针,简化了探针标记过程,降低了成本,并提高了标记效率。该文详述了水稻(Oryza sativa)改良后的双链寡核苷酸探针文库的合成及标记方法、有丝分裂时期染色体制片和探针杂交过程。通过设计梯度实验发现水稻中寡核苷酸荧光原位杂交技术染色体和寡核苷酸探针的最佳变性时间与温度分别为85℃ 3分钟30秒及90℃6分钟。该研究在水稻中建立染色体双链寡核苷酸荧光原位杂交技术,可为多种植物染色体制备与精准识别提供有力的工具。

新疆一例汉族家系β地中海贫血IVS-Ⅱ-654(C→T)的基因分析

应用聚合酶链反应结合等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交技术(PCR/ASO),对新疆首例β地中海贫血(β地贫)家系进行基因分析,从12名家系成员中检出7例β地贫基因突变(IVS-(?)-654,C→T)的杂合子。结合家系调查、临床症状及血液学检查结果,证实先证者的致病基因来源于父方。该研究对了解新疆地区β地贫基因突变类型和频率,以及开展产前诊断具有重要意义。

HLA-DQB1启动子多态性与原因不明习惯性流产发病的关联研究

目的 :探讨HLA DQB1启动子区域基因多态性是否与原因不明习惯性流产发病存在关联。方法 :采用聚合酶链反应 序列特异性寡核苷酸探针杂交方法 ,对 32例原因不明习惯性流产患者和 5 3例正常妇女 ,分析DQB1启动子区域基因多态性。结果 :发现DQB1启动子等位基因频率在两组中无统计学上差异 ,而QBP6 2 DQB1 0 6 0 4 0 6 0 5单元型在患者组中的表达频率是 12 5 % ,在对照组中频率是 2 83% ,两者相比差异显著 (RR =4 9,P <0 0 5 )。此外 ,还发现了 6种中国人新的QBP DQB1的单元型。结论 :DQB1启动子与原因不明习惯性流产不存在直接关联 ,但与DQB1组成的单元型可能是导致该病易感性的因素。

新疆一例汉族家系β地中海贫血ⅣS-Ⅱ-654(C→T)的基因分析

本文报道应用聚合酶链反应(PCR)结合等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针斑点杂交技术,对新疆首例p地中海贫血(p地贫)家系进行基因分析,从12名家系成员中检测出7例p地贫基因突变(ⅣS-Ⅱ-654,C→T)的杂合子。结合家系调查、临床表现及血液学检查结果,证明先证者的致病基因来源于父方。该研究对了解新疆地区p地贫基因突变类型和频率以及开展产前诊断具有重要意义。

DNA芯片的制作与应用

介绍了ＤＮＡ芯片的制作方法：支持物表面经活性处理后，采用原位合成法在支持物表面合成寡核苷酸探针，或用芯片外合成法制得探针后将探针通过喷墨打印法或化学方法固定到支持物上．探针与经过ＰＣＲ扩增、标记的生物样品杂交，检测杂交信号并进行分析以获得生物样品的遗传信息．讨论了该技术在诸如基因组研究、遗传分析、基因诊断等多方面的应用，并估计了今后的发展方向及前景．

人类白细胞抗原-DQB1与儿童十二指肠溃疡和幽门螺杆菌感染的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)-DQB1等位基因与儿童十二指肠溃疡(DU)和幽门螺杆菌(H.pylori)感染的遗传关联性。方法采用非同位素标记的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)杂交的方法,对上海地区汉族健康儿童80例、DU患儿58例的HLA-DQB1等位基因进行分型;并同时检测DU患儿H.pylori感染情况。结果在DU患儿中,HLA-DQB1×05031等位基因频率明显高于正常健康儿童(分别为:6.02%、0.63%,P<0.05,RR=9),而在H.pylori阳性和H.pylori阴性DU组之间差异无显著性。结论HLA-DQB1×05031与DU呈正相关,DU患儿与正常对照组儿童之间存在着遗传学的差异;虽然H.pylori感染是DU的重要致病因素,但HLA-DQB1×05031并不是通过H.pylori感染而影响DU的遗传易感性。

重症肌无力患者HLA-B易感基因研究

目的探讨中国汉族重症肌无力(MG)患者及其不同亚型与人类白细胞抗原(HLA)-B等位基因的相关性。方法应用聚合酶链反应-序列特异性的寡核苷酸探针杂交法(PCR-SSOP)对91例中国汉族MG患者及171名健康对照者进行HLA-B等位基因分型,并采用病例-对照研究及显性遗传模式的方法系统分析HLA-B等位基因与MG患者不同临床亚型之间的相关性。结果按照性别、年龄、临床类型、抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体及胸腺病变将患者组分为不同亚型后,结果显示HLA-B*46阳性率在男性、眼肌型、抗AChR抗体阴性及伴发胸腺瘤组中升高,HLA-B*08阳性率在早发型及全身型患者组中升高。与对照组比较,患者组HLA-B*35和B*38阳性率降低。结论 HLA-B*46基因可能是男性、眼肌型、抗AChR抗体阴性及伴发胸腺瘤的MG患者的易感基因或与易感基因相连锁;HLA-B*08可能是早发型及全身型MG患者的易感基因或与易感基因相连锁。HLA-B*35和B*38可能是MG的保护基因或与保护基因相连锁。

流式磁珠PCR-SSOP方法HLA基因分型可疑结果的确认分析

目的对PCR-SSOP方法未明确HLA分型结果的可疑样本进一步分型,并分析原因。方法对采用PCRSSOP方法进行HLA分型出现的131例可疑样本采用LABScan3D分型方法进行检测。对于3D分型仍不能确定的样本采用PCR-SBT分型方法进行检测。结果 131例可疑样本分析,其中87例LABScan3D分型方法可确定分型结果,余下的44例采用PCR-SBT获得分型结果,3种分型方法检测结果在低分水平上是完全一致的。结论 LABScan3D分型方法在PCR-SSOP的基础上进一步发展,可代替其进行大量样本的HLA分型,但是仍有引物探针的局限,不能代替SBT的地位。

硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1-copia类逆转座子的克隆及分析

利用Tvl—copia类逆转座子逆转录酶（RT）的保守区域设计引物，优化了扩增条件后利用RT—PCR从白桦愈伤组织中得到了1条逆转录酶序列。利用硝普钠（SNP）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后分别扩增克隆了11条和9条逆转录酶序列。这2l条逆转录酶序列（命名Bprtl-21）变化范围为205—290bp，一致性为71．93％，异质性为1．1％。50．9％，翻译成氨基酸的异质性为0～57．1％。经SNP和MeJA处理的样品中，获得的逆转录酶序列基本是分别聚类．初步证明不同的Tvl-copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。分析所获得的21逆转录酶序列和苹果中19务逆转录转座子序列（DQ410748-DQ410766）进化关系发现．逆转录酶基本各自聚类。但是Bprt9、Bprtll和OQ4m750进化关系比较接近，Bprt15、Bprt19、DQ410751和DQ410753聚为一类，证明逆转座子存在水平传递。

一例白血病患者及家系HLA-B基因全长序列及18个点突变分析

背景:人类白细胞抗原HLA经过长期进化形成丰富的多态性,近几年由于受检人数增加及HLA分型技术快速发展,HLA新基因不断被发现。目的:采用下一代测序技术对1例白血病患者及家系HLA-B基因的全长序列及18个点突变进行分析。方法:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的HLA-B结果异常。为了鉴定该基因,采用下一代测序技术对该基因全长进行测序,同时采集患者父亲、母亲及2位同胞姐妹的血样进行HLA基因的遗传学分析。结果与结论:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本HLA-B无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现,与同源性最高的等位基因B*15:09:01相比,该基因在外显子、内含子和3′UTR共存在18个碱基突变。5个外显子碱基突变位于第3,4外显子,分别为:第486位G→C、第583位T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T,导致5个相应密码子发生改变,其中2个碱基替换为错义突变,第171位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第194位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者HLA-B新基因来源于父亲。新基因序列已递交给Genbank数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了1个HLA-B新等位基因,该基因于2017年12月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。

武汉地区儿童β地中海贫血基因突变类型分析

目的 探讨武汉地区儿童β地中海贫血致病基因分布情况。方法 选择2013年1月至2015年1月在武汉市妇女儿童医疗保健中心就诊的经血细胞分析筛选出的疑似β地中海贫血患儿274例，其中男性178例，女性96例；年龄6个月 ～ 14岁，平均年龄为2.83岁。采集乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA）抗凝静脉血，提取白细胞DNA，采用PCR寡核苷酸探针反向斑点杂交法（PCR-RDB）进行β地中海贫血基因检测，对基因突变位点和基因型进行分析。结果 274例β地中海贫血初筛患儿中确诊152例，检出率为55.47 %（152/274）。共检出9种等位基因突变，分别为IVS-2-654、CD41-42、CD17、CD43、CD71-72、CD27-28、-28、-29、CD26；3种最常见的突变位点IVS-2-654、CD41-42、CD17分别占到全部等位基因突变的43.81 %（85/194）、23.20 %（45/194）、12.89 %（25/194）。共检出26种β地中海贫血基因型，9种单纯杂合子110例（占72.37 %，110/152），13种双重杂合子36例（占23.68 %，36/152），4种纯合子6例（占3.95 %，6/152）。结论 β地中海贫血是武汉地区贫血患儿的重要原因之一；武汉地区β地中海贫血患儿以IVS-2-654位点的突变最为常见。

探讨流式HLA-B27平均荧光强度用于原发强直性脊椎炎及继发性脊椎炎的鉴别诊断

目的探讨B27平均荧光强度用于原发性强直性脊椎炎(AS)及继发性脊椎炎鉴别诊断的可能性及B27 DNA亚型差异对流式B27平均荧光强度的影响;对流式(FCM)B27/B7双标法用于AS患者B27表达情况的测定进行评估。方法采用FCM双标法、微量淋巴细胞毒试验(CDC)及引物特异性多聚酶链反应(SSP-PCR),对76例正常人、57例原发AS病和106例继发性脊椎炎进行B27测定;并用寡核苷酸探针杂交(SSOPH)对50例B27血清学阳性原发AS进行B27 DNA分型。结果原发性AS及继发性脊椎炎患者B27平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05);HLA B27 04型和HLA B27 05型的流式B27平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05);CDC、SSP-PCR和FCM双标法特异性和敏感性分别为76.3%和78.5%、88.4%和86.3%、86.8%和88.85%。结论FCM B27平均荧光强度尚不能用于原发性AS及继发性脊椎炎患者鉴别诊断;不同B27 DNA亚型的B27平均荧光强度可能无差异;FCM HLA-B 27/B7双标法是一种快捷、简便、高效的HLA-B27检测方法。

CYP2D6PCR基因型与DXT表型和基因芯片检测的比较(英文)

目的 :为了评价CYP2D6的基因型和表型的联系以及基因芯片在CYP2D6多基因分析中的应用。方法 :2 4 2健康志愿者 ,口服dextromethorphan后收集尿液测定其代谢率 ,收集 2 0ml血提取DNA ,并通过基因特异性PCR和 / (或 )基因芯片分析CYP2D6 2——— 11, 17和多拷贝CYP2D6基因 ,其中 5个基因 ( 3、 4、 6、 7和 9)用PCR和CYD4 5 0基因芯片同时分析。结果 :CYP2D6基因型比表型更富有信息和更能反映CYP2D6酶的表达。CYP2D6 3、 4、 6、 7和 9的基因检测在CYP4 5 0基因芯片和基因特异性PCR中显示高度的一致性。结论 :基因芯片在检测基因多位点的多基因中是一个有发展前途和可靠的方法。

盐皮质激素受体基因多态性与妊高征相关性研究

目的 探讨中国人群中盐皮质激素受体基因 (MR)外显子 3上A76 0G多态性与妊高征的相关性。方法 以人外周血DNA为模板 ,通过聚合酶链式反应 -等位特异性寡核苷酸杂交 (PCR -ASO)方法测定 95例随机妇女、10 1例正常孕妇、6 0例妊高征妇女的MR外显子 3上A76 0G多态性频率。结果 MR外显子 3上A76 0G多态性位点中A等位基因和C等位基因在正常孕妇组中分别为 83.17%与 16 .83% ,在妊高征组中分别为 84 .17%与 15 .83% ,在随机人群组中分别为 86 .84 %与 13.16 %。结论 中国人群中MR基因外显子 3上存在A76 0G多态性 ,该多态性与妊高征不存在相关性。

新疆11例β地贫CDs41/42(-TTCT)的基因分析

目的:研讨新疆的11例β地中海贫血的基因突变.方法:应用PCR/ASO技术进行基因分析.结果:鉴定为CDs41/42(—TTCT)基因突变,其中汉族8例、维吾尔族2例、瑶族1例,均为杂合体.维吾尔族中的这种突变型系首次报道.这些先证者都有地贫症状,伴有程度不同的贫血和HbA_2增高(3.39%～6.67%),分散在新疆的广大地区.结论:为了解这种突变类型在我国的分布情况提供了新资料.

β地中海贫血IVS-Ⅱ-654(C→T)的基因鉴定

目的：总结新疆１６例β地中海贫血ＩＶＳⅡ６５４（Ｃ→Ｔ）的基因分析结果。方法：应用聚合酶链式反应和寡核苷酸探针杂交。结果：对新疆１６例β地中海贫血先证者进行基因分析，鉴定为ＩＶＳⅡ６５４（Ｃ→Ｔ）基因突变，均为杂合子，其中汉族１１例，回族４例，维吾尔族１例。回族中这种突变类型属首次报道。