人卵巢癌顺铂耐药细胞中核糖体蛋白基因的表达谱分析

目的研究核糖体蛋白基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达。方法以顺铂为诱导剂,采用中等剂量、间歇作用法建立人卵巢癌顺铂耐药细胞系COC_1／DDP,然后以其亲本细胞COC_1为对照,应用cDNA微阵列检测COC_1／DDP细胞的核糖体蛋白基因表达。结果与COC_1细胞相比,COC_1／DDP细胞对顺铂有6．2倍耐药性,细胞倍增时间延长了8．9h,S期细胞减少了(27．4±2．13)％,而G_1和G_2期细胞分别增加了(19．6±3．71)％和(8．3±1．95)％。在143个表达水平发生改变的基因中,有12个核糖体蛋白基因表达下调,多个凋亡抑制基因表达上调,凋亡诱导基因CASP2表达下调。结论 COC_1／DDP细胞对顺铂具有耐药性,耐药性的产生可能与部分核糖体蛋白基因的表达下调有关。

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA。方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达。结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达。结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列。

cDNA芯片检测STAT5诱骗核苷酸对K562细胞凋亡相关基因的影响

目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提取decoy ODNs处理前后的K562细胞总RNA,逆转录合成Cy3、Cy5标记的cDNA探针,与人14K基因表达谱cDNA芯片(V2.0)杂交,扫描获得数据后,用Genespring软件分析对照组和实验组的差异表达基因,半定量RT- PCR验证cDNA芯片结果。结果：2张cDNA芯片检测重复性良好(R=0.9799)。在13824个标记的基因中,检出413个上调基因,其中包括：TIAF1、GAB1、GYPA、DAPK3、TNFRSF1B、IRF1和PML等在内的18个凋亡相关基因；在检出的332个下调基因中,发现PIM1、CCND2、CCND1、MYC和BCL2L1等在内的11个凋亡相关基因；部分基因经半定量RT-PCR证实与cDNA芯片结果一致。结论：Decoy ODNs抑制STAT5信号通路后可引起K562细胞多种凋亡相关基因的变化,本实验为进一步研究STAT5信号通路所调控的凋亡相关基因提供了依据。

基因芯片检测耐利福平结核分枝杆菌准确性的Meta分析

目的对基因芯片方法在检测耐利福平结核分枝杆菌的准确性进行系统评价，为基因芯片技术应用于临床检测耐药结核分枝杆菌的必要性提供证据。方法计算机检索The Cochrane Library（2014年第1期）、PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI数据库，检索时限均为建库至2014年2月。由2位研究者根据纳人与排除标准独立筛选文献、提取资料，采用评价诊断准确性质量研究（quality assessment of diagnostic accuracy studies，QUADAS）条目评价纳入研究论文的方法学质量，检出相关文献223篇，按照标准纳入22篇文献。采用Meta-DiSc1．4软件对其敏感度（SEN）、特异度（SPE）、阳性似然比（＋LR）、阴性似然比（-LR）、诊断比值比（DOR）进行异质性检验和合并分析，绘制汇总受试者工作特征（SROC）曲线，计算曲线下面积（AUC）。结果共纳入22篇文献（包括一篇多中心研究文献），25个研究，包括4879株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株，其中耐RFP菌株（1314株）、敏感菌株（3565株）。基因芯片技术检测Mtb对RFP耐药的SEN△并为0．89[95％CI（0．87-0．91）]、SPF合并为0．98[95％CI（0．97-0．98）]、＋LR为30．891-95％CI（22．15-43．06）]、-LR为0．10[95％CI（0．07-0．15）]、DOR合并为354．06[95％CI（212．09-591．07）]、AUC为0．9833。结论基因芯片方法具有较好的诊断价值；以传统药敏法为金标准，基因芯片方法特异度、敏感度，诊断OR值均较高，说明其在Mtb对RFP耐药检出率较高，可作为临床结核分枝杆菌耐药检测的辅助手段。

乙型肝炎病毒X蛋白羧基端30个氨基酸缺失突变体转染Huh7细胞的基因表达谱和蛋白质组差异分析

目的:本课题组既往研究显示乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)羧基端30个氨基酸的缺失突变雄(△HBx)具有明显不同于野生型HBx(wtHBx)的细胞生物学效应,因此,本研究进一步探讨△HBx和wtHBx导致Huh7细胞差异生物学效应的分子基础。方法:采用cDNA芯片和双向凝胶电泳方法,从基因和蛋白质组水平,对分别转染了△HBx和wtHBx的Huh7细胞进行检测。结果:cDNA芯片检测结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在193个基因(0．95％)的显著性改变,154和39个基因分别显示表达上调和下调。双向凝胶电泳结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在147个蛋白差异点。基因表达谱和质谱分析结果显示,△HBx组差异表达的基因和蛋白主要涉及宿主细胞的基因转录、细胞连接、信号转导和代谢、免疫应答等过程及癌基因和抑癌基因。结论:HBx缺失突变体对细胞基因和蛋白质的影响是广泛的,涉及肝组织特异性的代谢基因的变化。这些差异表达的基因和蛋白质在HBx突变致癌过程中是否发挥了重要的作用,需要进一步的研究证实。

CK7、CK14、CK19和CK20在胃肠癌转移诊断中价值的新发掘

目的：重新评估CK7、CK14、CK19和CK20在胃肠癌淋巴结微转移中的诊断价值和意义。方法：采用组织芯片和免疫组化方法检测CK7、CK14、CK19和CK20在正常黏膜(n=112)、原发癌(n=112)、淋巴结转移癌(n=106)和肝脏转移癌(n=37)中的表达,比较它们在转移灶与原发灶间表达差异以及与临床病理参数之间的关系。结果：CK19在各种组织中的表达均为100%,原发癌和转移癌间呈一致性表达；而CK20和CK7的表达随肿瘤的发生和进展逐步下降,淋巴结转移灶中的表达水平显著低于原发癌中的表达水平(P＜0．05),CK20和CK7的下降表达与肿瘤的浸润深度有关(P＜0．05)；CK7的下降表达与肿瘤的远处转移有关(P＜0．01),胃癌中CK7的表达率高于肠癌中的表达(P=0．003),CK20正好相反(P＜0．001)。CK14在各种组织中的表达率较低,在胃肠癌的诊断中的价值不大。结论：CK19是检测胃肠癌转移的一个理想指标,而CK20和CK7在检测微转移中价值有待评估,其表达下调可能在胃肠癌发展至转移中起重要作用。

凋亡相关基因在喉鳞癌中的表达概况

目的了解凋亡相关基因在喉鳞状细胞癌中的表达概况,探寻其在喉鳞癌及正常喉组织中的表达差异及意义。方法提取喉鳞癌及癌旁正常喉组织的总RNA,采用Ampolablaleing-LRP方法,分别将上述提取的RNA合成生物素标记的cDNA探针。将合成的探针与细胞凋亡GEArrayQ芯片膜(96个凋亡相关基因)进行杂交。采用化学发光方法.并用X感光片记录喉鳞癌标本和对照标本的基因信号表达强弱。将X光片感光点转化成TIFF图形文件,使用ScanAlyze和GEArrayAnalyzer软件进行资料分析。结果利用基因芯片杂交筛选的方法,在所分析的与凋亡相关的96个基因中,survivin、bcl-2、TNF-β/Lta、TNF-α等23个基因在喉鳞癌组织中表达上调;bak、bax、bik、p53等22个基因表达下调。结论通过细胞凋亡GEArrayQ芯片膜杂交筛查的方法发现,在喉鳞癌中抑制凋亡的基因表达上调,促进凋亡的基因表达下调,这些基因改变组成了喉鳞癌特异的与凋亡相关的基因表达谱,为全面系统地研究喉鳞癌中与凋亡相关基因表达情况,及探讨喉鳞癌的发病机制提供了有益的线索。

去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响

目的:本实验通过高通量的cDNA微阵列技术,研究去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响,寻找雌激素的靶基因。方法:用1400个基因构建的cDNA微阵列检测假手术组(Ⅰ)、去卵巢组(Ⅱ,去势组)和雌激素替代治疗组(Ⅲ,替代组)3组SD雌鼠心肌组织的基因表达差异,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:假手术组和去势组共检出心肌差异表达的基因177个,其中去卵巢导致上调的基因91个,下调的基因86个;去势组和替代组共检出心肌差异表达的基因164个,其中雌激素替代治疗后导致上调的基因113个,下调的基因54个。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅱ比较,相同的差异表达基因54个,雌激素明显影响心肌膜通道和载体(18个)、细胞受体(9个)、信号转导相关基因(7个)和细胞代谢(6个)的mRNA水平。而大部分基因(45个)是在去势组表达下调,在雌激素替代组表达上调。RT-PCR实验证实了cDNA微阵列结果。结论:长期雌激素替代治疗明显影响心肌细胞膜通道和载体、信号转导、细胞受体和细胞代谢等相关基因的表达。长期雌激素替代治疗可通过增加Na+,K+-ATPase和Na+/H+交换蛋白的基因表达,稳定心肌细胞内Na+和K+的浓度。雌激素还可抑制多巴胺受体基因的表达,预防心肌肥大、充血性心衰等心脏疾病的发生。

脓毒症大鼠心脏基质金属蛋白酶及其抑制物基因的表达变化

目的:探讨脓毒症大鼠心脏中基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制物(TIMP)的基因表达谱变化及其与脓毒症导致的心脏损伤的关系。方法:雄性3月龄Wistar大鼠20只,随机均分为2组,分别以盲肠结扎针刺法建立脓毒症动物模型或行假手术作为对照组。术后24h快速摘取心脏,以Langendorff离体鼠心灌注法测量大鼠心功能参数,其后做心脏病理检查,并以寡核苷酸基因芯片检测基质金属蛋白酶及其抑制物基因在2组大鼠心脏组织中的表达差异。结果:脓毒症大鼠心脏无明显病理改变,但心功能明显下降,表明大鼠心脏处于抑制状态;基因芯片结果显示:20个MMP基因中14个表达上调3倍以上,包括胶原酶MMP8、明胶酶(MMP2和MMP9)、基质溶解素(MMP3、MMP7及MMP10)和膜型金属蛋白酶(MMP15、MMP17和MMP24)等;4个TIMP基因中仅TIMP3基因表达上调。结论:脓毒症时心脏组织中多种MMP基因表达上调、MMP/TIMP基因表达失衡,可能导致心肌抑制和ECM重构,是脓毒症诱发心脏损伤的重要分子机制。

恶性肿瘤转移相关基因改变的起源

经典的肿瘤转移理论认为,转移是肿瘤细胞克隆选择的结果,在肿瘤内部仅有少数肿瘤细胞具有转移潜能,且转移发生在肿瘤进展的晚期。然而随着基因芯片技术的应用,通过对不同转移潜能的乳腺癌细胞亚群进行基因表达谱分析发现,不同转移潜能的细胞亚群表达出不同临床预后的基因表达标志。高转移潜能乳腺癌细胞亚群的“差预后(poor prognosis sig-nature)”基因表达标志可预测乳腺癌患者的高转移潜能和低生存率;而“好预后(good prognosis signature)”的基因表达标志则预测相反的结果。肿瘤细胞的这种转移潜能在肿瘤形成的早期已经存在,且原发肿瘤中的大部分细胞均具有相应的转移能力。在乳腺癌患者,通过对临床标本的研究表明好预后和差预后的基因表达标志能较准确地预测预后。在不同类型肿瘤的原发病灶和转移瘤之间的基因表达谱基本相同,而伴有和不伴有转移的相同类型原发瘤之间的基因表达谱有明显差异,这也说明肿瘤转移相关基因改变发生在肿瘤形成的早期。当然,和所有新理论的出现一样,这一理论尚需通过相关的实验进一步验证。

针刺对大鼠脑组织神经生物学基因表达的研究

目的采用基因芯片技术,分析探讨针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤作用的分子机制。方法取雄性Wistar大鼠6只,3只为正常对照组,另3只为针刺预处理组。针刺组先行“肾俞”“百会”针刺预处理,出针后0.5h断头取脑。基因芯片技术进行基因表达差异分析。结果针刺预处理后0.5h,大鼠脑组织表达变化大于2倍的基因共265个,20个基因表达差异具有显著性意义(P<0.05)。其中8个基因表达上调,12个基因表达下调;涉及神经元信号传递类(离子通道、递质、受体、第二信使)基因11个,涉及转录调控类基因5个,涉及代谢酶类基因2个,涉及热休克反应类基因1个,涉及细胞骨架类基因1个。结论一些针刺诱导的基因表达产物在针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤过程中发挥了重要作用;针刺预处理后神经细胞功能状态的改变可能是其随后发挥抗脑缺血再灌注损伤作用的重要基础。

艾滋病合并分枝杆菌感染患者分枝杆菌菌种鉴定

目的：对艾滋病合并分枝杆菌感染患者菌株标本进行菌种鉴定，评价MPB64抗原胶体金法快速检测试剂盒鉴别分枝杆菌的价值。方法：对艾滋病患者临床标本中培养出的140株分枝杆菌菌株用16SrDNA测序的方法进行菌种鉴定，分析艾滋病患者中常见非结核性分枝杆菌（NTM）菌种，同时对这些标本用MPB64抗原免疫胶体金法进行菌株鉴定，分析后者的敏感性和特异性。结果：以16SrDNA测序结果为金标准，MPB64抗原胶体金法快速检测区分结核分枝杆菌（MTB）与NTM的敏感性和特异性分别为96．00％和96．84％。共有114份标本（114／140，81．43％）获得明确鉴定结果，其中50份（43．86％）为MTB，63份标本（55．26％）鉴定为NTM。最常见的NTM菌种为戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。结论：MPB64抗原胶体金法检测分枝杆菌菌种具有较好的特异性，且快速、经济、简便，适合用于临床对MTB及NTM的初步鉴别。艾滋病合并结核患者中NTM的比例较高，需进行菌种鉴定以指导临床治疗。

构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的:构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1-IGF-1),为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法:实验于2005-04/06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1。结果:实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以反转录-聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子1基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1成功,实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因的3'端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,即保留了胰岛素样生长因子1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。

新基因pp3774抑制NIH/3T3细胞生长机制初探

目的探讨新基因pp3774在NIH／3T3细胞生长调节中的可能机制。方法用pp3774-HA融合表达质粒通过脂质体法转染NIH／3T3细胞,G418筛选,建立稳定细胞系,并用RT-PCR检测pp3774在NIH／3T3细胞中mRNA的表达状况；利用Atlas cDNA array分析pp3774的异位表达对NIH／3T3细胞基因表达谱的影响；用RT-PCR方法验证Atlas cDNA array杂交结果。结果 pp3774超表达可以明显下调cyclin D1、cyclin E、转录因子Dpl等基因的表达,同时可上调P13K p85α、FGF7、MMP-2等基因的表达。上述基因表达的改变可能通过调控细胞周期实现pp3774对NIH／3T3细胞的生长抑制。结论新基因pp3774抑制NIH／3T3细胞生长可能与pp3774基因下调cyclin D1、cyclin E、转录因子Dpl的表达有关。

ChIP-chip及ChIP-seq的应用现状及其发展前景

目前主要应用染色质免疫共沉淀-芯片（chromatin immunoprecipitation-chip,ChIP-chip）与ChIP-测序（ChIP-sequencing,ChIP-Seq）技术在全基因组范围内分析组蛋白修饰、转录因子结合位点（transcription factor binding site,TFBS）、核小体的定位或其他染色质蛋白结合位点的表观遗传机制,组蛋白修饰是控制基因转录的关键因素之一，

利用组织芯片检测上皮型钙黏素在宫颈癌浸润转移中的作用

目的检测上皮型钙黏素E-cad在宫颈鳞癌中的表达,探讨其在浸润转移中的作用。方法利用组织芯片的免疫组化染色对10例正常宫颈上皮、63例无淋巴结转移宫颈鳞癌、63例有淋巴结转移宫颈鳞癌组织中E-cad的蛋白表达进行检测。结果E-cad在正常宫颈组织的表达高于宫颈鳞癌P<0.05,在无淋巴结转移宫颈鳞癌组织显著高于有淋巴结转移组织(P<0.05),且E-cad的表达与淋巴结转移相关(P<0.05)。结论E-cad与宫颈鳞癌的浸润转移密切相关,可用于判断预后及指导临床治疗。

应用基因表达谱芯片研究内毒素诱导的人树突细胞成熟前后免疫相关基因的差异表达

目的研究人外周血来源的树突细胞(DCs)经内毒素诱导成熟过程中基因表达谱的改变。方法采用GM-CSF及IL-4诱导人外周血单核细胞获得非成熟DCs,以100ng/ml内毒素(LPS)作用48h获得成熟DCs,收集细胞提取总RNA,应用SuperArray低通量全长基因cDNA芯片筛选DCs成熟前后差异表达的基因。结果经LPS诱导后DCs高表达成熟DCs表面标志物。经LPS处理48h后诱导成熟的DCs与未经处理的非成熟DCs相比,共有50条基因出现差异表达,占芯片基因总数的30.3%。其中35条基因表达增加,15条基因表达下降。细胞因子/受体和趋化因子/受体基因中有12条表达上调,2条表达下调,抗原获取及提呈相关分子中有10条表达上调,5条表达下调,膜受体及信号转导分子中13条表达上调,8条表达下调。RT-PCR进一步证实了基因表达谱芯片的结果。结论LPS对DCs成熟过程中的基因表达具有显著影响,其范围涉及细胞因子、趋化因子及受体,抗原提呈相关分子及细胞内信号转导分子等。分析这些差异基因的表达,对进一步全面了解DCs成熟过程有重要意义。

骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后BMP4基因差异表达的初步研究

目的初步探讨骨髓基质干细胞(BMSC)向神经元样细胞分化前后骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的表达变化情况。方法体外培养大鼠BMSC,用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天行基因芯片检测BMP4基因表达水平,并采用实时定量PCR进行验证。结果在BMSC向神经元样细胞诱导分化后的芯片表达谱中,BMP4基因的表达明显上调,且实时定量PCR亦证实此结果。结论在BMSC向神经元样细胞的分化过程中,BMP4基因可能发挥着重要的作用。

应用组织芯片技术研究EphB4的表达和临床病理学意义

目的运用组织芯片技术研究肺癌组织中EphB4的表达及其临床病理学意义。方法采用免疫组化S-P法检测240点阵组织芯片上54例肺癌和10例正常肺组织EphB4蛋白的表达情况,并与相应病例大块组织常规免疫组化结果进行比较。结果组织芯片与免疫组化技术相结合时,若要兼顾诊断的准确性和经济性,以每例病例取2个点为佳。EphB4蛋白在实验组中的阳性表达率为44.4%(24/54),对照组为阴性,二者之间差异具有显著性(P<0.01);EphB4表达阳性率与大体类型、组织学分级、临床分期有关(P<0.05),而与性别、年龄、组织学分型及淋巴结转移无关(P>0.05)。结论EphB4与肺癌的发生和恶性行为有关。检测肺癌中EphB4的表达情况可作为判断肿瘤预后的新靶点;组织芯片是可以快速、准确进行肿瘤分子病理研究的技术平台。