c─k─ras反义寡核苷酸抑制Hce─8693细胞生长的序列特异性研究

ｃ─ｋ─ｒａｓ反义寡核苷酸抑制Ｈｃｅ─８６９３细胞生长的序列特异性研究钱瑛，董海涛，余应年，陈星若（浙江医科大学病理生理学教研室及医学分子生物学实验室杭州３１００３１）原癌基因的突变激活和抑癌基因的失活是恶性肿瘤发生发展的分子生物学基础。选择性抑制突...

人乳头瘤病毒分型长链寡核苷酸芯片的制备

目的制备用于人乳头瘤病毒(HPV)初步检测和分型的长链寡核苷酸基因芯片。方法对4型HPV(6,11,16,18)全基因组序列进行分析,设计特异性高、熔解温度(Tm)和GC含量相近的HPV型特异性长链寡核苷酸探针,点样制备成寡核苷酸基因芯片,利用限制性显示技术对HPV样品进行荧光标记,并将标记好的样品与芯片杂交,以了解寡核苷酸基因芯片在HPV病毒检测和分型中的作用。结果荧光标记的HPV样品与多个型特异性HPV探针杂交有明显的荧光信号,可以根据杂交结果进行初步的分型检测。结论采用设计合理的60mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对HPV的检测和分型。

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法根据脑脊液标本中常见病原菌16S rRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物,制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针,以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增,扩增过程中用生物素标记;将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交,检测脑脊液中细菌的感染情况。结果所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。

DNA芯片技术与脱氧核糖核酸序列分析

人类基因组计划的实施 ,有力地促进了 DNA序列分析技术的发展。DNA芯片综合运用了固相合成化学、照相平版印刷技术以及激光共聚焦扫描等技术 ,能够同时扫描分析众多基因乃至基因组 ,可广泛应用于基因的多态性分析、基因定位、表达水平的监测以及遗传病的诊断等领域 ,是对传统的 DNA分析技术的一次重大突破。本文介绍了 DNA芯片技术的基本原理并对其应用作一简要综述。

150例慢性丙型肝炎患者HCV基因型和NS3蛋白酶编码区序列的分析

目的对来源于我国不同地区的150例慢性丙型肝炎患者进行HCV基因分型和NS3蛋白激酶编码区序列分析。方法基因分型采用基因芯片法;NS3区序列扩增采用自行设计的型特异性引物介导巢式RT-PCR,序列分析采用PCR产物直接测序。结果 150例患者HCV基因分型结果为1b占66.7%(100/150),2a占22.7%(34/150),3a占4%(6/150),3b占4%(6/150),6型占2%(3/150),1a占0.7%(1/150)。对NS3区序列采用进化树分析进行分型,其结果与基因芯片法分型结果高度一致,主要基因型(1a、2b)的NS3区序列无明显地区性聚集倾向。未检出与新型HCV蛋白酶抑制剂telaprevir耐药相关的V36M/A、T54A、R155K/T和A/156V/T变异。结论我国慢性丙型肝炎患者仍以1b型感染为主,采用NS3蛋白酶编码区序列分析可同时进行基因分型和针对蛋白酶抑制剂的耐药变异检测,我国天然存在的相对优势变异株发生telaprevir原发耐药的可能性很小。

诊断性传播疾病寡核苷酸芯片的研制

目的:探索寡核苷酸芯片的制备方法,并利用芯片技术进行性传播疾病的快速、平行诊断。方法:借助生物信息学方法,设计引物及特异性探针,制备芯片,与收集的性病阳性标本进行杂交,经显色,分析结果。结果:经过对收集到的19例性病的阳性标本进行杂交分析,都能显出特异性的斑点。结论:本研究用生物信息学方法设计的引物、探针是合理的,芯片用于性传播疾病的诊断是可行的。

全基因组寡核苷酸芯片筛选与胰腺癌相关的基因信号通路

背景:胰腺癌的发病率有所上升,且缺乏诊断标记物和治疗措施。近年研究表明,基因信号通路在胰腺癌发病中起重要作用。目的:探讨与胰腺癌相关的基因信号通路。方法:6例经病理证实的胰腺癌及其癌旁组织纳入研究。抽提总RNA,合成两种组织探针,探针荧光标记和纯化后,与Agilent全基因组寡核苷酸芯片进行杂交,对差异基因进行生物信息学分析,筛选与胰腺癌相关的信号通路。结果:差异基因的KEGG Pathway分析发现肾细胞癌通路分类对胰腺癌最具生物学意义,其中TGFβ3、EPAS1、PIK3R3、EGLN1、PGF、ETS1、VEGFB、CREBBP和PIK3R5九个关键基因的表达有显著差异(P<0.05)。结论:胰腺癌发病与肾细胞癌通路激活密切相关,可能为胰腺癌的研究提供新的思路。

雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸抗前列腺癌细胞增殖的研究

目的 探讨反基因策略对雄激素受体(AR)表达和前列腺癌细胞增殖的影响。方法 针对AR基因2 4 4 7～2 4 6 1核苷酸序列设计并合成三螺旋形成寡核苷酸(TFO) ,经脂质体介导转染LN CaP前列腺癌细胞株,于转染后2 4、4 8、72h分别采用3H 胸腺嘧啶核苷(TdR)参入实验测定癌细胞增殖活性,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法检测ARmRNA表达,用放射配基结合分析法(RBA)单点法检测AR蛋白质表达,并与反义寡核苷酸(ASON)相比较。结果 2 4、4 8、72hTFO组LNCaP细胞的AR表达水平明显低于ASON组(P <0 0 5 ) ,TFO对LNCaP细胞增殖的抑制率显著高于ASON(P <0 0 5 )。结论 该TFO能有效抑制AR表达和前列腺癌细胞增殖。

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

背景:近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:探索中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法:应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术,对1名27岁男性汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论:PCR-序列特异性寡核苷酸探针结果显示该样本HLA-B基因座反应格局出现异常提示;基因测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列最相近的等位基因B*55:02:01的差异只是在第3外显子发生了nt 412 A→G一个核苷酸替代,导致第138位密码子由AAC→GAC,相应的编码的天冬酰胺改变为天冬氨酸。将其序列提交国际基因数据库及IMGT/HLA数据库,证实该HLA等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-B*55:46(HM989018)。

西尼罗病毒60mer寡核苷酸探针的设计

[目的]设计西尼罗病毒诊断芯片的60mer寡核苷酸探针。[方法]使用NCBIBlast软件对病毒的基因序列进行对比,获得特异性序列,以Oligo6.0对特异性序列进行探针的设计。[结果]设计出10条60mer寡核苷酸探针,为下一步芯片的制备做准备。[结论]将Blast序列分析和Oligo6.0的探针设计功能相结合能快速有效地设计出诊断芯片的寡核苷酸探针。

HCMV 60-mer寡核苷酸诊断芯片的探针与微阵列设计

目的设计用于人巨细胞病毒(HCM V)诊断的60-m er长链寡核苷酸探针及微阵列。方法利用生物学软件A rray D es igner2.0,针对HCM V特异且保守的序列设计60-m er探针,利用BLA ST功能将设计探针在G enB ank数据库进行序列比对分析,筛选得到HCM V特异性O ligo探针,根据各探针的属性特点设计芯片阵列。结果设计得到24条解链温度(Tm值)相近、长度均一的60-m er O ligo探针及其芯片阵列,拟打印成DNA芯片用于HCM V检测。结论利用病原体的生物信息学资料及A rray D es igner2.0生物软件,能有效的进行病毒检测芯片的设计。

RASSF1B基因的克隆及序列分析

目的克隆RASSF1B基因并观察其序列。方法采用RT-PCR从胃腺癌细胞AGS、肝癌细胞HEPG2、高转移肺癌细胞95D、肺腺癌细胞LTEP-a-2、白血病细胞U937中克隆RASSF1B基因,用生物信息学方法对克隆基因的序列进行分析。结果RASSF1B在5种肿瘤细胞中均有表达。序列分析显示,该基因中有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。结论在胃腺癌、肝癌、高转移肺癌、肺腺癌、白血病细胞中成功克隆出RASSF1B基因,该基因序列中含有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。

线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建

目的构建用于线粒体DNA(mtDNA)D-环控制区(D-LOOP区)多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D-LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N’-对羧苄基吲哚三菁(Cy5)标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D-LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D-LOOP区片段(466bp)与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0.1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基"C"的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D-LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。

高性价比寡核苷酸基因表达谱芯片的制备方法

目的探讨探针长度对寡核苷酸(Oligo)基因芯片杂交信号的影响。方法以大肠杆菌基因表达信息作为实验模型,根据已有大肠杆菌全基因组芯片数据选择覆盖高、中、低杂交信号强度的20个大肠杆菌基因,针对该20个基因分别设计59-mer和70-mer长度Oligo探针,并将2种探针点制在同一张芯片中,同时设阳性对照探针和阴性对照点样液。提取大肠杆菌RNA,经过反转录、扩增、荧光标记后与芯片进行杂交反应,采用激光共聚焦扫描仪扫描芯片,利用数据分析软件提取探针的杂交信号值并进行显著性分析。结果大肠杆菌28SrRNA和18SrRNA条带清晰,无降解带出现,质量合格。芯片杂交结果显示59-mer和70-mer长度探针的杂交效率和杂交信号差异无统计学意义(P=0.9810),阳性对照探针出现阳性杂交信号,阴性对照点样液未检测到杂交信号,符合质控要求。结论59-mer长度探针可用来制备Oligo基因芯片,这不仅降低了基因芯片制作成本,而且将推动基因芯片技术更为普及的应用。

PCR引物浓度对寡核苷酸液相杂交的影响

目的考察PCR引物浓度配比对液相微珠杂交效率的影响,寻求具有较强杂交信号和较好稳定性的PCR引物浓度配比。方法建立HLA-DRB1等位基因的相关数据库,选择在HLA-DRB1位点的第二外显子上设计探针,并且选择其保守序列作为阳性对照探针(DPC2),DPC2探针中间位点T突变成A作为阴性对照探针(DNC)。分别针对标本C2-008、C2-024、C2-025的等位基因序列设计出6条约21bp的寡核苷酸探针,各探针5’端用氨基(NH2)修饰。通过引物浓度梯度配比(1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1),对型别已知的细胞株DNA进行PCR扩增并得到目的片段(1:100配比除外),在相同条件下将PCR产物与寡核苷酸探针进行液相杂交检测。结果浓度配比为1:1的对称式扩增产物杂交结果不理想,而浓度配比分别为1:20、1:8、1:4、1:2的不对称扩增均得到了待检单链、双链DNA混合物,其中1:4浓度配比具有最好的扩增效率和稳定性。根据阳性信号与阳性标本是否相符表明:引物浓度配比为1:100的不对称PCR和1:1的对称PCR检测效果差,易出现假阴性;1:2、1:4、1:8、1:20配比检测效果较好,比较稳定。结论PCR引物浓度配比影响液相微珠杂交效率,不对称PCR产物有利于提高杂交效率,为快速成功配制PCR试剂奠定了基础,有利于寡核苷酸液相芯片的应用。

人类白细胞抗原新等位基因B＊07：110的序列分析及确认

背景:近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:采用序列分析确认1例中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法:应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术进行样本的人类白细胞抗原基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论:聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针结果显示,该样本人类白细胞抗原B基因座反应格局出现异常;基因测序结果表明,其B基因座第2外显子序列与所有已知人类白细胞抗原B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列同源性最高的等位基因B*07:01:02的差异是在第2外显子发生了nt 226和nt 228两个A->G核苷酸取代,导致第76位密码子由ATA->GTG,相应的导致氨基酸由异亮氨酸(I)改变为缬氨酸(V)。将其序列提交国际基因数据库(Gen Bank)及IMGT/HLA数据库,证实该新人类白细胞抗原等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原B*07:110(HM989017)。

西藏青稞染色体多样性分析

为了解西藏青稞的染色体多样性,从西藏六个地区共采集124个青稞品种,每个品种取3个单株,基于南京农业大学开发的寡核苷酸探针ONPM#8(Oligonecleotide probe multiplex#8),利用荧光原位杂交(fluoresence in situ hybridization,FISH)技术对所有品种进行染色体鉴定,并建立可以区分全部染色体的青稞参考核型。结果表明,采集到的青稞植株有26种染色体多态类型,其中5种多态类型(1H-1、2H-2、4H-1、5H-1和7H-4)的频率大于50%。染色体多态性信息含量(PIC)分析发现,3H染色体最多(PIC=0.75),5H染色体最少(PIC=0.00)。372个单株存在明显的核型变异,涉及染色体多态性、杂合性和异质性,其中261个单株为纯合类型,其余111个单株为杂合类型,平均每株包含1.15对杂合染色体,说明新采集的青稞涉及染色体多样性,可通过后续个体选择和后代鉴定选育出纯系品种。