色谱技术在肝素结构分析中的研究进展

肝素(heparin,Hp)是目前临床应用最为广泛的抗凝剂,是由重复二糖单元组成的多硫酸化酸性直链多糖。低分子量肝素(LMWHs)是以肝素为原料,经过化学或酶降解获得的相对分子质量相对较小的肝素衍生物,相对肝素,它们的出血副作用和免疫原性更小,皮下注射时生物利用度更高。肝素及低分子量肝素具有一系列结构特点,如相对分子质量偏大且有一定分布,多种糖残基同时存在,硫酸酯位置和数量呈现多样化,以及不同工艺产生的特殊残基的种类和含量不一等。该类药物结构的复杂性对分析方法提出了巨大的挑战,也限制了其质量控制提升、工艺优化、临床用药安全和新适应证拓展等。该文以色谱分析方法为中心,从结构分析的不同角度,包括单糖、二糖、寡糖、多糖的识别、组成分析和不同层次,系统地梳理和阐述近年来肝素类药物在色谱分析方法上的进展,并对这些方法的应用范畴、创新性、局限性等进行总结。该文将为肝素类药物的结构分析、质量控制提供较系统的方法学参考,为更多新方法开发提供思路,为更深入地研究肝素类药物结构、拓展其应用提供有力支撑。

基于高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱的寡糖轮廓分析用于蜂蜜中淀粉糖浆的掺假鉴别研究

采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱（HPLC-Q/Orbitrap MS）建立了寡糖轮廓分析的方法。通过对纯天然蜂蜜和淀粉类糖浆中的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖进行定性定量分析,发现淀粉类糖浆中含有未被酶解完全的微量麦芽类寡糖,且麦芽七糖在所有检测样本中干扰小,对结果的定量无影响,而其他寡糖类物质的定性和定量结果会存在干扰。最终选择麦芽七糖作为蜂蜜中掺入淀粉糖浆的典型标志物。在实际样品分析中,根据麦芽七糖的保留时间和离子对的相对丰度比可以定性判断蜂蜜中是否掺有淀粉糖浆;通过标准曲线法可以定量测定样液中麦芽七糖的含量。在20,50,100 mg/kg 3个加标水平下,麦芽七糖的平均回收率为75%-82%,相对标准偏差（RSD,n=5）为3.1%-6.7%,方法检出限为0.1μg/m L。应用该方法可在10 min内完成整个分析过程,且样品前处理简单,结果可靠,灵敏度高,可用于纯天然蜂蜜中掺入淀粉糖浆的快速确证和检测。

一种刺松藻来源的硫酸阿拉伯聚糖的制备及特征结构表征

刺松藻(Codium fragile)经水提-醇沉获得粗多糖,进一步将刺松藻粗多糖(CFP)通过Q-Sepharose Fast Flow(QFF)阴离子交换柱纯化得到6个多糖组分CFP1～CFP6,其中,在CFP6中发现纯度较高的阿拉伯聚糖.采用高效凝胶渗透色谱与十八角激光散射仪联用法和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法对CFP6的分子量及单糖组成进行了分析.结果表明,CFP6是一种分子量为79290的多糖,由阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)组成,二者摩尔比为14. 8∶1. 0.通过多维核磁共振波谱、液相色谱-质谱联用及二级质谱等方法对CFP6的糖苷键连接方式及其寡糖序列结构进行表征,进一步阐明了该复杂多糖的特征结构.经判断,CFP6主链由Ara组成,通过β-(1→3)糖苷键连接,在Ara的C2位存在分支结构,硫酸基位于Ara的C4或C2位.

亚慢性砷中毒小鼠大脑与小脑线粒体呼吸链相关基因的差异表达研究

目的应用毒理基因芯片技术观察三氧化二砷（As2O3）对小鼠大、小脑线粒体呼吸链相关基因表达谱的影响，为探讨砷的神经毒性机制提供特征性基因表达信息资料。方法30只昆明种小鼠按体质量随机分为对照组、低剂量组和高剂量组，每组10只，分别连续饮用含As2O3为0、1、4mg／L的蒸馏水60d。断头法处死小鼠，提取脑组织后，利用基因芯片技术检测小鼠脑组织线粒体相关基因表达谱的变化。结果与对照组比较，染砷组小鼠脑组织中差异表达的线粒体呼吸链相关基因共有26条。其中大脑线粒体呼吸链表达上调的基因有Ndufs4和Slc25a5，表达下调的基因有Ndufa12、Ndufab1、Ndufb2、Sdha、Uqcr、Cox6a2、Cox17、Atp5a1、Atp5g1、Atpif1和Slc25a3；小脑线粒体呼吸链表达上调的基因有Ndufa4、Ndufa6、Ndufs8、Atpif1和Slc25a1，表达下调的基因有Ndut08、Ndufa12、Sdha、Uqcr、Cox17、Atp5a1、Atp5g1和Slc25a3。结论亚慢性砷暴露可影响小鼠大脑和小脑线粒体呼吸链相关基因表达，尤其以诱导基因表达下调为主，其中对线粒体复合体I和复合体V各亚单位基因表达的影响较为明显。

GII.6型诺如病毒P蛋白原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达GII.6型诺如病毒(norovirus,NoV)P蛋白和制备多克隆抗体。方法扩增NoV GII.6型P区基因并克隆至pET28a载体,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导进行原核表达。使用Ni-NTA亲和柱层析进行纯化,重组蛋白进行寡糖结合分析,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,western blot(WB)检测抗体的特异性,并进行有效性评估。结果成功构建了原核表达载体GII.6P-pET28a并表达相对分子质量约40×10^3的GII.6型P蛋白;Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上;寡糖结合显示GII.6型P蛋白与B、leb、H2型结合,与A、H1、lea型不结合;ELISA测得抗体的效价为1∶160000;WB显示抗体具有较高特异性;交叉实验未显示出对GII.4的亲和力。结论成功表达了GII.6型P蛋白并获得高效价的抗体,为GII.6的检测和疫苗研发提供有效工具。