敲低PDK4改善线粒体-内质网偶联结构延缓D-半乳糖诱导的心肌细胞衰老

目的:探究敲低丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)对D-半乳糖(D-gal)诱导的心肌细胞衰老的影响及对线粒体-内质网偶联结构(MAMs)的调节作用。方法:通过将si-PDK4重组质粒及阴性对照si-NC重组质粒转染至大鼠心肌细胞H9c2中以敲低PDK4表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)测定转染效果。将H9c2细胞分为对照组、D-gal组、si-NC+D-gal组、si-PDK4+D-gal组。对照组正常培养,D-gal组给予10 g/L D-gal诱导48 h,si-NC+D-gal组与si-PDK4+D-gal组分别转染si-NC、si-PDK4后再给予10 g/L D-gal诱导48 h,结束后收集各组H9c2细胞,细胞活性检测(CCK-8)法检测各组细胞活性,β-半乳糖苷酶活性(SAβ-gal)染色判定各组细胞衰老状态,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针法检测各组细胞活性氧(ROS)水平,细胞荧光染色检测各组细胞MAMs,Western Blot测定各组细胞中线粒体融合蛋白-2(MFN2)蛋白表达水平,Fluo-3 AM荧光探针法检测各组细胞钙离子(Ca^(2+))水平。结果:转染si-PDK4的H9c2细胞中PDK4 mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均低于转染si-NC的H9c2细胞与正常H9c2细胞(P<0.05),提示成功敲低PDK4表达。与对照组比较,D-gal组H9c2细胞存活率下降,SAβ-gal标记的衰老细胞比例增加,ROS水平升高,MAMs共定位减少,MFN2蛋白相对表达量下调,细胞内Ca^(2+)水平增加(P<0.05)。与D-gal组和si-NC+D-gal组比较,si-PDK4+D-gal组H9c2细胞存活率升高,SAβ-gal标记的衰老细胞比例减少,ROS水平下降,MAMs共定位增加,MFN2蛋白相对表达量上调,细胞内Ca^(2+)水平减少(P<0.05)。结论:敲低PDK4能够延缓D-gal诱导的心肌细胞衰老,其作用机制可能与增加MAMs形成以促进细胞内Ca^(2+)运转有关。

半乳糖凝集素-1与局部晚期食管鳞状细胞癌患者术前同步放化疗疗效和预后的关系

目的分析半乳糖凝集素(Gal)-1与局部晚期食管鳞状细胞癌(ESCC)患者术前同步放化疗(CCRT)疗效和预后的关系。方法收集2017年1月至2022年12月期间82例行CCRT联合食管癌切除术的局部晚期ESCC患者临床病历资料。采用免疫组化染色检测ESCC组织Gal-1表达,用半定量免疫反应评分进行评估。记录患者病理完全缓解(pCR)情况、总生存期(OS)、无病生存期(DFS)。结果Gal-1表达与淋巴结侵犯有关(P=0.004),与年龄、性别、临床分期、T分期、N分期及血管侵犯均无关(P>0.05)。30例患者达到pCR。pCR患者的组织Gal-1表达明显低于未达到pCR的患者[4.00(4.00,4.00)vs.8.00(8.00,12.00),Z=-4.830,P<0.001]。Gal-1表达预测局部晚期ESCC患者术前CCRT疗效达到pCR的受试者工作特征曲线下面积为0.801(95%CI:0.698~0.904)。与Gal-1表达≥6分的局部晚期ESCC患者比较,Gal-1表达<6分患者的中位DFS更长[9.57(2.1~53.5)个月vs.22.1(2.8~55.2)个月,P=0.034],中位OS也更长[16.7(6.4~53.5)个月vs.27.9(2.8~55.2)个月,P=0.003]。单因素及多因素Cox风险比例回归模型显示,Gal-1表达是影响局部晚期ESCC患者OS、DFS的独立因素(P<0.05)。结论在接受术前CCRT的局部晚期ESCC患者中,Gal-1高表达预示较差的疗效和预后。

β1,4-半乳糖基转移酶1对气道平滑肌细胞炎症反应的影响

为了探究β1,4-半乳糖基转移酶1(β4GalT1)在气道平滑肌细胞中的功能,通过高通量基因表达数据库(GEO)分析β4GalT1在气道平滑肌细胞炎症反应存在功能,采用脂多糖刺激气道平滑肌细胞后检测白介素1β及β4GalT1的表达;采用慢病毒包装构建过表达β4GalT1的稳转细胞,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测稳转细胞中炎症相关细胞因子表达随时间的变化,同时通过细胞增殖实验、细胞周期和划痕实验检测稳转细胞的生物学行为变化,研究过表达β4GalT1的细胞分泌液在调节细胞因子表达过程中的作用。结果表明:脂多糖能引起白介素1β及β4GalT1的表达量增加;随着培养时间的延长,过表达β4GalT1的细胞中促炎因子表达量减小,抑炎因子表达量增加,同时过表达β4GalT1可改变气道平滑肌细胞的增殖、迁移行为,进而起到炎症修复功能;过表达β4GalT1的细胞可通过分泌液调节细胞因子的表达,表明β4GalT1能快速响应对气道平滑肌细胞的炎症刺激,并通过分泌物质调节气道平滑肌细胞的细胞行为及细胞因子变化。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215通过调控能量代谢酶保护脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰竭小鼠机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂ACY1215对急性肝衰竭(ALF)小鼠的保护作用及其可能的作用机制。方法将30只小鼠随机分为对照组、模型组和ACY1215处理组,采用脂多糖和D-氨基半乳糖联合腹腔注射诱导小鼠ALF模型,常规行血生化和组织病理学检查,采用Western blot法检测肝组织苹果酸脱氢酶1(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH1)和果糖-2,6-二磷酸酶2(PFKFB2)及白介素-1β(IL-1β)和IL-18分子蛋白的表达。结果肝组织病理学检查显示,ALF模型制备成功,而ACY1215干预组肝组织病理学损害显著减轻;模型组血清ALT、AST和TBIL水平分别为(3743.5±655.9)U/L、(2539.4±488.1)U/L和(89.56±7.2)μmol/L,显著高于对照组【分别为(34.5±7.6)U/L、(32.3±9.3)U/L和(6.2±2.4)μmol/L,P<0.05】,而ACY1215处理组各项指标均显著降低【分别为(951.5±328.9)U/L、(475.3±131.24)U/L和(38.41±9.5)μmol/L,P<0.05】;模型组小鼠肝组织MDH1和IDH1表达较对照组显著减弱,PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较对照组显著增强,而ACY1215干预组肝组织MDH1和IDH1表达较模型组显著增强,而PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较模型组显著减弱。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215可以通过对能量代谢酶的调节发挥保护ALF小鼠的作用。

半乳糖凝集素-3、白细胞介素35、白细胞介素17在支气管哮喘病儿血清中的水平及与肺功能的相关性

目的探究半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、白细胞介素35(IL-35)及白细胞介素17(IL-17)在支气管哮喘病儿血清中的水平及临床意义。方法选取2021年8月至2022年8月徐州医科大学附属医院诊治的哮喘病儿77例,分为轻中度哮喘急性发作组(40例)及哮喘缓解组(37例),选择同期徐州医科大学附属医院健康体检儿童26例为对照组。采用酶联免疫法测定血清Galectin-3、IL-35、IL-17水平。应用肺功能仪进行肺功能检查,记录第1秒用力呼气容积/1 s用力呼气量预计值百分比(FEV1%)、1 s用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、最大呼气50%瞬间流量(FEF50%),最大呼气75%瞬间流量(FEF75%)指标。结果轻中度急性发作组Gal-3、IL-17水平分别为(50.89±7.90)ng/L、(60.95±8.14)ng/L,明显高于缓解组的(33.93±9.49)ng/L、(42.94±6.67)ng/L及对照组的(24.8±5.84)ng/L、(35.45±8.68)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。轻中度急性发作组IL-35水平为(101.28±9.44)ng/L明显低于缓解组(125.91±7.79)ng/L及对照组(148.83±8.09)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。轻中度急性发作组FEV1%、FEV1/FVC水平分别为(67.22±12.11)%、(67.56±12.60)%明显低于缓解组的(95.4±10.63)%、(95.58±10.95)%和对照组的(108.21±10.49)%、(108.9±10.03)%,均差异有统计学意义(P<0.05),FEF50%、FEF75%在轻中度急性发作组分别为(46.22±11.80)%、(38.42±9.94)%,与缓解组的(50.11±11.53)%、(42.76±12.39)%比较,差异无统计学意义(P>0.05),与对照组(91.75±12.43)%、(93.84±12.07)%比较差异有统计学意义(P<0.05)。Gal-3与IL-17呈正相关(P<0.05),IL-35与IL-17呈负相关(P<0.05),Gal-3、IL-17与FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈负相关(P<0.05),IL-35与FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈正相关(P<0.05)。结论哮喘病儿Gal-3表达上调,IL-35表达下调,引起IL-17促表达增强、表达抑制作用减弱,IL-17水平升高从而导致气道炎症加重,可能是轻中度哮喘急性发作的发病机制之一;亦可能是哮喘缓解期部分病儿小气道炎症持续存在的可能机制之一。Gal-3、IL-35、IL-17水平测定有助于预测轻中度哮喘急性发作风险及指导调整吸入糖皮质激素(ICS)用药。

β-1,3半乳糖基转移酶-1和β-1,3半乳糖基转移酶-2在乳腺癌中的表达及临床意义

目的检测β-1,3半乳糖基转移酶-1(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT1)和β-1,3半乳糖基转移酶-2(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT2)在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系,并分析其相关通路。方法选取乳腺癌及癌旁组织标本132例,采用Western Blot法和免疫组化方法检测B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达,分析其临床意义。通过基因集富集分析法探索相关通路。结果乳腺癌组织中B3GALT1和B3GALT2表达均低于癌旁正常组织(P<0.05),二者表达呈正相关(r=0.635,P<0.001),且两者表达阳性患者与阴性患者的T分期和Ki-67比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B3GALT1和B3GALT2均富集于JAK-STAT通路和Notch通路。结论B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌中低表达,与乳腺癌的增殖、生长密切相关。

β-1,3-半乳糖基转移酶2对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制

目的探讨β-1,3-半乳糖基转移酶2(B3galt2)对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制。方法将成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型组、MCAO模型+慢病毒载体对照组(LV-GFP组)、MCAO模型+慢病毒载体过表达B3galt2组(LV-B3galt2组),每组6只。各组小鼠于脑缺血24 h后进行神经功能缺损评分和旋转棒实验,采用2,3,5-三氨基苯甲四氮唑染色测定脑梗死体积,采用尼氏染色法观察各组小鼠脑缺血半影区神经元数量,检测各组小鼠脑组织中氧化应激相关因子水平。结果与Sham组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死体积增大,神经功能缺损明显(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显减少,活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明显升高(均P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平明显降低(均P<0.05);与MCAO模型组比较,LV-B3galt2组小鼠脑梗死体积减小,神经功能明显改善(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显增加,ROS和MDA水平明显降低(均P<0.05),SOD和GSH水平明显升高(均P<0.05)。结论B3galt2过表达可以减轻脑缺血损伤模型小鼠脑损伤,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应实现的。

血清半乳糖凝集素-1、白细胞介素-12水平联合检测对重度子痫前期患者发生胎盘早剥的预测价值

目的:分析血清半乳糖凝集素-1(Gal-1)、白细胞介素-12(IL-12)水平联合检测对重度子痫前期(SPE)患者发生胎盘早剥的预测价值。方法:回顾性分析2021年2月至2023年12月该院收治的82例SPE患者的临床资料,设为研究组,选取同期82名在该院进行正常孕检的健康孕妇,设为对照组,并根据SPE患者分娩前是否发生胎盘早剥将其分为发生患者和未发生患者,比较两组及发生、未发生患者血清Gal-1、IL-12水平,采用Pearson相关性,分析血清Gal-1、IL-12水平与SPE患者发生胎盘早剥的相关性,并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Gal-1、IL-12水平单项及联合检测对SPE患者发生胎盘早剥的预测价值。结果:研究组血清Gal-1、IL-12水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);发生患者血清Gal-1、IL-12水平均高于未发生患者,差异有统计学意义(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示,血清Gal-1、IL-12水平与SPE患者发生胎盘早剥均呈正相关(r>0,P<0.05);ROC曲线分析结果显示,血清Gal-1、IL-12水平单项及联合检测预测SPE患者发生胎盘早剥的曲线下面积分别为0.811、0.896、0.931,且联合检测预测价值最高。结论:血清Gal-1、IL-12水平联合检测对SPE患者发生胎盘早剥的预测价值高于二者单项检测。

盐酸氨溴索雾化吸入联合注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠对新生儿感染性肺炎的血清半乳糖凝集素-3白细胞介素-17水平的影响

目的分析将注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠及盐酸氨溴索雾化吸入联合用于新生儿感染性肺炎,对血清半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)水平的影响。方法选取2021年1月—2024年1月泉州市第一医院收治的106例感染性肺炎新生儿作为研究对象,按照治疗方式的不同分成对照组和观察组,各53例。对照组采用注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠治疗,观察组在对照组基础上加用盐酸氨溴索雾化吸入治疗。比较2组治疗前后Gal-3、IL-17、肺功能指标[最大呼气流速(peak expiratory flow,PEF)、潮气量(tidal volume,VT)],比较2组不良反应发生情况。结果治疗前,2组Gal-3、IL-17及肺功能指标对比,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,观察组的Gal-3、IL-17水平分别为(4.96±0.52)μg/L、(9.52±1.54)μg/L,较对照组的(6.75±0.89)μg/L、(12.47±2.08)μg/L更低,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组PEF为(5.86±1.39)L/s、VT为(7.49±1.24)mL/kg,较对照组的(4.51±1.02)L/s、(6.38±0.97)mL/kg更高,差异有统计学意义(P<0.05);2组不良反应发生率(5.66%vs 7.55%)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论将注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠、盐酸氨溴索雾化吸入联合用于新生儿感染性肺炎的疗效较好,有利于改善新生儿的炎症状态,促进肺功能改善,值得临床推广。

miR-212-3p靶向MAPK3调控骨髓间充质干细胞的衰老

背景:骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞表现出明显衰老状态,并且细胞活性及成骨分化水平显著降低。miR-212-3p能够抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化,但其对骨髓间充质干细胞衰老调控的作用及机制尚不明确。目的:研究miR-212-3p通过靶向丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)对骨髓间充质干细胞衰老的影响及其机制。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,收集第3代进行以下实验:①分2组培养:对照组加入完全培养基,造模组加入含H_(2)O_(2)的完全培养基培养,培养72 h后,检测细胞中β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p和MAPK3 mRNA表达,以及MAPK3、p16和p21蛋白表达。②分3组培养:对照组、抑制物对照组、miR-212-3p抑制物组,转染24 h后,检测细胞中miR-212-3p、MAPK3 mRNA表达及MAPK3蛋白表达。③采用双荧光素酶报告基因联合qRT-PCR和Western blot验证miR-212-3p与MAPK3靶向调控作用。④分组培养:分为对照抑制物组、miR-212-3p抑制物组、miR-212-3p抑制物+干扰对照组、miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,转染24 h后,检测细胞中MAPK蛋白与mRNA表达。分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+对照抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+干扰对照组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,细胞转染24 h后再加入H_(2)O_(2)培养72 h,检测细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶活性、p16和p21蛋白表达。结果与结论:①与对照组比较,造模组β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p mRNA表达及p16、p21蛋白表达升高(P<0.05),MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。②与对照组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中miR-212-3p mRNA表达降低(P<0.05),MAPK3 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05)。③双荧光素酶报告基因实验证实,MAPK3是miR-212-3p下游靶基因。④与对照抑制物组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05);与miR-212-3p抑制物组比较,miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组细胞中p16和p21蛋白表达降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中p16和p21蛋白表达升高(P<0.05)。⑤结果表明,下调miR-212-3p可抑制大鼠骨髓间充质干细胞衰老,其作用机制可能是通过靶向上调MAPK3表达实现的。

知母-黄柏药对改善D-半乳糖诱导衰老小鼠认知障碍的机制研究

目的:研究知母-黄柏药对(简称“知柏”)对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老模型小鼠认知障碍的改善作用,并探讨其作用机制。方法:将75只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组(D-gal 125 mg/kg)、吡拉西坦组(468 mg/kg)、知柏组(4.5 g/kg)和雷帕霉素哺乳靶蛋白(mTOR)抑制剂组(依维莫司,RAD001,3mg/kg),每组15只。通过D-gal建立小鼠衰老模型,并连续8周灌胃给予知柏水煎液。采用Morris水迷宫和新物体识别测试评价衰老模型小鼠的认知功能;HE染色法观察各组小鼠海马组织病理变化情况;尼氏染色和高尔基染色观察海马区神经元和突触的病理形态变化;收集海马组织以测定脑内三磷酸腺苷(ATP)含量,Western Blot法检测海马中泛素结合蛋白62(P62)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1)、突触素(Syn)、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、mTOR的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测海马中Syn、AMPK、mTOR基因表达水平。结果:与空白组相比,模型组小鼠在Morris水迷宫和新物体识别测试中表现出认知功能显著降低(P<0.01)。在模型组中,海马区的细胞数量减少,细胞排列松散,神经元形态不规则,尼氏小体数量明显减少,树突分支数量以及树突棘密度也显著减少。模型组小鼠海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95、mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin-1表达显著升高(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著升高(P<0.01),Syn和mTOR基因表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,吡拉西坦组和知柏组小鼠的认知功能得到了显著改善,表现为Morris水迷宫测试中潜伏期的显著缩短(P<0.01),穿越平台次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01),以及新物体识别指数的显著升高(P<0.01),海马区树突棘密度显著增加(P<0.01),神经元损伤也在一定程度上得到了缓解。海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05),Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05),Syn、mTOR基因表达显著升高(P<0.01)。抑制剂RAD001组与模型组结果相似,经知柏治疗后上述指标均有所回调。结论:知柏可能通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制神经元过度自噬,增强突触可塑性,改善由D-gal引起的小鼠认知障碍。

二精丸对去卵巢+D-半乳糖联合Aβ1-40致肾阴虚AD大鼠学习记忆能力的影响

目的探讨二精丸对去卵巢+D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)致肾阴虚阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力的影响。方法在采用D-半乳糖+去卵巢法建立肾阴虚大鼠模型的基础上,联合海马注射Aβ1-40建立肾阴虚AD学习记忆障碍大鼠模型。雌性SD大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、二精丸高剂量组(9.0 g·kg^-1)、二精丸中剂量组(4.5 g·kg^-1)、二精丸低剂量组(2.25 g·kg^-1)、阳性药组(多奈哌齐,1.0 mg·kg^-1)。每日1次,连续灌胃给药30 d。通过Morris水迷宫试验、新物体识别试验检测大鼠学习记忆能力;采用HE染色、尼氏染色观察大鼠海马神经元细胞形态;免疫组化法测定大鼠海马雌激素β受体(ERβ)、Aβ及p-tau404蛋白表达水平;ELISA法测定大鼠血清的雌激素水平。结果与模型组比较,二精丸中、高剂量组从第3天开始逃避潜伏期显著缩短(P<0.05,P<0.01),高剂量组的穿越平台次数明显增加(P<0.05),新物体识别指数明显升高(P<0.05);二精丸组大鼠海马区神经元、尼氏小体数量增多,形态较完整,排列较整齐,无破损,核仁清晰;二精丸中、高剂量组大鼠海马区阳性Aβ细胞数显著减少(P<0.01),血清雌激素水平显著升高(P<0.05,P<0.01);二精丸高剂量组大鼠海马区p-tau404阳性细胞数量明显减少(P<0.01);二精丸高、中、低剂量组大鼠海马区ERβ阳性细胞数量增多(P<0.01)。结论二精丸可能通过上调大鼠脑内ERβ表达和雌激素水平,减少脑内Aβ淀粉样蛋白的沉积,抑制tau蛋白的过度磷酸化,从而改善肾阴虚AD大鼠的学习记忆能力。

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 。

APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS和PI3K表达的影响

目的通过对胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）在海马表达的观察，研究APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元信号转导途径上游步骤的影响。方法小鼠随机分为3组，每组22只：正常对照组（C组）、D-半乳糖模型组（D组）、APP17肽治疗组（D＋P组）。D、D＋P 2组每日皮下注射半乳糖100mg·kg^-1。D＋P组每周一、二、五皮下给药APP17肽0．35μg／只。4个月后，小鼠灌注固定，行脑冰冻切片，用PI3K、IRS-1、IRS-2抗体进行免疫组化染色。Western blot应用IRS—1抗体染色。结果免疫组织化学染色方法检测海马神经元胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2、PI3K的表达，结果显示3种抗体C组深染的阳性细胞排列整齐。染色深，突起深染，可见2—3级分支，细胞计数与D组差异有显著性；D组海马阳性反应细胞着色浅，少有突起，细胞数目少，分别为正常对照的67．5％、63．68％和48．6％。APP17肽治疗组（D＋P组）染色结果与C组相似，阳性细胞数目接近C组，与半乳糖老化组比较差异均有显著性，P〈0．05，但阳性细胞突起少于C组，排列亦不如C组整齐。Western blot结果亦显示D组海马表达IRS-1减少，应用17肽后IRS-1表达上调，但不如C组数值高。结论D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS—1、IRS-2、PI3K的表达明显下降；APP17肽能上调D-半乳糖老化小鼠海马IRS—1、IRS-2和PI3K的表达。

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌Enterobacter agglomerans B1:筛选鉴定、发酵产酶及其合成低聚半乳糖的研究

从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化。最佳培养基主要组份为:乳糖1%,酵母粉1%,蛋白胨0.5%;发酵条件为:初始pH7.5,发酵温度25℃,发酵时间26h。在该培养条件下产酶量为9.7U/mL。利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为:pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液;50℃反应12h。最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析,确定低聚半乳糖产量为40.7%,组分为转移二糖、三糖和四糖。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

苹果L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶cDNA克隆及其表达

【目的】了解苹果果实L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP)基因的特性,探索苹果GPP基因表达特性及其与抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平的关系。【方法】通过RT-PCR从苹果果实中克隆GPP全长cDNA,分析其序列特征,进行原核表达,制备GPP特异抗体,分析GPP mRNA及其蛋白表达水平与苹果不同组织AsA的关系。【结果】从‘嘎啦’苹果果实中克隆的GPP cDNA(GenBank登录号为FJ752240)包含的最大开放阅读框(open reading frame,ORF)为813 bp,编码270个氨基酸残基,预测分子量为29 kD,该基因与其它植物报道的GPP基因具有较高的相似性,但与肌醇-1-磷酸磷酸酶基因差异较大。构建的pET-32a(+)-GPP载体在大肠杆菌BL21(E.coli BL21)中异源表达后,获得主要以包涵体存在约50 kD的融合蛋白GPP-His(His约21 kD)。以该蛋白制备抗体,与重组蛋白的Western杂交表明该抗体能与GPP发生特异反应。对苹果可溶性蛋白杂交显示,苹果体内GPP蛋白约33 kD。在苹果不同组织中,GPP mRNA与蛋白质的相对表达水平与AsA含量存在明显的一致性。【结论】以单体形式存在的苹果GPP蛋白具有翻译后修饰特性,且该基因的表达在苹果AsA合成调控中可能起重要作用。

支气管哮喘患儿血清及支气管肺泡灌洗液中半乳糖凝集素-3和转化生长因子-β1的变化

目的探讨半乳糖凝集素-3(Gal-3)、转化生长因子-β1(TGF-β1)在哮喘患儿血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的变化及临床意义。方法采用ELISA法测定和比较45例哮喘患儿(哮喘组)及15例气管异物或气道畸形患儿(对照组)血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平。结果哮喘组患儿的血清和BALF中的Gal-3、TGF-β1水平均较对照组高;中重度哮喘患儿的血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平均高于轻度哮喘患儿,差异均有统计学意义(P均<0.05)。哮喘组患儿血清中的Gal-3、TGF-β1水平与相应的BALF中的Gal-3、TGF-β1水平呈显著正相关(r=0.910、0.914,P均<0.05);血清中Gal-3水平与TGF-β1水平呈显著正相关(r=0.932,P<0.05)。结论哮喘患儿血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平均明显升高,可能参与了哮喘的发生、发展。

山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。