慢性病毒性肝炎2′-5′寡腺苷酸合成酶活性研究

ＰＰＰＡ２Ｐ５Ａ２Ｐ５Ａ寡腺苷酸（简称２′－５′Ｐ３Ａ３）是干扰素作用细胞后诱生的２′－５′Ｐ３Ａ３合成酶利用ＡＴＰ为原料合成的物质〔１〕。它具有广泛的生物学活性如抗病毒〔２〕、抗肿瘤、免疫调节及大分子生物合成抑制作用〔３〕。本文选择慢性乙肝病人７４...

抗粘病毒1和2′5′-寡腺苷酸合成酶1基因与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞中抗粘病毒1(MX1)基因和2′5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)1基因的实时定量表达水平与SLE临床表现及病情活动度的相关性。方法收集50例SLE患者,20例非SLE其他自身免疫性疾病患者,25例健康对照人群的临床资料,取外周血抽提总RNA并逆转录成cDNA,运用SYBR green dye I实时定量聚合酶链反应(QT-PCR)在ABI PRISM 7000基因测序仪上检测患者和对照组的MX1和OAS1定量表达水平(以ΔCt值表示)的差异,并与各临床指标及病情活动度进行相关性分析。结果①SLE患者总体的MX1 mRNAΔCt值(3.55±1.39)高于非SLE患者组(2.31±0.52,P=0.000)和正常人(2.23±1.05,P=0.000)。②SLE患者组的OAS1 mRNAΔCt值(4.45±1.56)高于非SLE患者组(3.03±0.76,P=0.000)和正常人(2.75±0.64,P=0.000)。③SLE患者组的OAS1 mRNAΔCT值与SLEDAI积分之间有相关性(r=0.338,P=0.019),与血浆IgA水平有相关性(r=0.475,P=0.001)④SLE患者组的MX1 mRNAΔCT值与SLEDAI积分之间无相关性(r=0.064,P=0.661),与甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)2、4 h尿蛋白均有相关性(r=0.428,P=0.003;r=0.383,P=0.009;r=0.394,P=0.007;r=0.316,P=0.025)。⑤在有关节炎的SLE患者中,其MX1和OAS1表达水平升高更明显(3.04±1.42,P=0.004;3.89±1.49,P=0.006)。结论MX1与OAS1在SLE患者中均有表达上调现象,OAS1 mRNA实时表达定量水平对SLE患者的病情活动度判断有意义。二者作为Ⅰ型干扰素诱导表达的基因在SLE发病中均有各自作用。

鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)^TM,经终浓度为0.5 mmol·L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L^-1 Tris-HCL和0.10 mol·L^-1NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21(PLYSS)^TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L^-1纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

HBV感染患者2′,5′寡腺苷酸合成酶、IL-2和IL-12水平检测及意义

目的:选用2′,5′寡腺苷酸合成酶(2-5OAS)作为干扰素观察指标,IL-2、IL-12作为Th1应答观察指标,了解内源性干扰素系统和Th1应答在HBV感染发病机制中作用。方法:用放射同位素法测定单核细胞2-5OAS活性;ELISA法测定血清IL-2、IL-12。结果:无症状HBsAg携带组2-5OAS、IL-2、IL-12含量与正常对照组无显著差异(P>0.05),急性肝炎组均显著高于正常对照组(P<0.01),慢性乙型肝炎轻、中、重度组、慢性重型肝炎组、肝硬化组、肝癌组均显著低于正常对照组(P<0.05),并且随慢性肝炎病情加重以及肝硬化、肝癌发生而递减,其中肝硬化、肝癌组处于最低水平(与慢性肝炎各组比较P<0.05)。结论:在HBV感染发病过程的不同阶段和不同临床分型患者中,其内源性干扰素系统和Th1应答反应都是有显著差异的,细胞免疫对病毒感染的痊愈起主导作用。

2′,5′-寡腺苷酸合成酶L和干扰素诱导蛋白2基因与系统性红斑狼疮相关性研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞中干扰素诱导表达2′,5′-寡腺苷酸合成酶L(OASL)和干扰素诱导蛋白2(IFIT2)基因的实时定量表达水平与SLE疾病特异性和疾病活动的相关性。方法收集50例SLE患者,25例非SLE自身免疫性疾病患者,25例健康对照人群的临床资料,取外周血抽提总RNA并逆转录成cDNA,运用SYBR green dyeI实时定量聚合酶链反应(PCR)在Bio-Rad 96孔基因测序仪上检测SLE患者组和非SLE患者组及健康对照组的OASL和IFIT2 mRNA定量表达水平(以ΔCT表示)的差异,并根据各病情不同进行分组比较,以及对其与SLEDAI和临床各相关指标相关性进行评价分析。结果SLE患者总体OASLmRNAΔCT值(4.83±0.41)与非SLE患者(3.26±0.47)差异有统计学意义(P=0.029),与健康对照者(3.07±0.54)差异有统计学意义(P=0.014)。SLE患者总体IFIT2 mRNAΔCT值(2.85±0.41)与非SLE患者(1.19±0.52)差异有统计学意义(P=0.019),与健康对照组(1.07±0.47)差异有统计学意义(P=0.011)。SLE患者总体OASLmRNAΔCT值与SLEDAI有相关性(r=0.324,P=0.022),与免疫球蛋白A(IgA)有相关性(r=0.357,P=0.012),IFIT2 mRNAΔCT值与SLEDAI有相关性(r=0.399,P=0.004),与血白细胞有相关性(r=0.393,P=0.005),与IgA有相关性(r=0.283,P=0.049)。结论OASL和IFIT2在SLE患者中均表达上调,对SLE患者的病情活动度判断有意义,两者在SLE发病中均有一定作用,抑制其过度表达可能成为治疗SLE的新方法。

不同剂量干扰素治疗慢性乙型肝炎时血清2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性的变化

目的:观察不同剂量干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎时血清2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-OAS)的变化,了解细胞抗病毒状态建立与乙肝病毒复制的关系。方法:32例慢性乙肝患者随机分为3蛆,即1MU干扰素腹腔注射11例(治疗Ⅰ组),3MU干扰素皮下注射11例(治疗Ⅱ组),分别连续注射5天,以后每周3次,共16周,并与不用干扰素治疗的10例(对照组)作对比,通过2′,5′-OAS、ALT、HBeAg、HBV-DNA(PCR法)连续检测,评价治疗反应。结果:疗程结束时,两治疗组和对照组ALT均下降,3组差异无显著性(P>0.05)。治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组2′,5′-OAS的活性均增加,治疗Ⅰ组在疗程结束时达峰值,治疗Ⅱ组在疗程早期就明显升高,而对照组无升高(P<0.05)。2′,5′-OAS的增幅水平与HBeAg、HBV-DNA的阴转呈相关性。结论,2′,5′-OAS可能是监测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的有效指标。

腹透液的生物相容性对2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性的影响

目的 :观察使用商业腹透液时 2′ ,5′-寡腺苷酸合成酶活性的动态变化和腹膜病理改变 ,探讨长期腹膜透析腹透液生物相容性对机体免疫功能影响和腹膜间皮的病理改变。方法 :①使用 3种常用腹透液建立腹膜透析动物模型 ;②用纸层析法动态测定实施和停止腹膜透析时 ,2′ ,5′ -寡腺苷酸合成酶活性的消长 ;③在光镜下观察腹膜间皮病理变化。结果 :腹膜透析时 ,各腹膜透析组和生理盐水组 2′,5′ -寡腺苷酸合成酶活性均升高 ;停止腹膜透析 ,生理盐水组 2′ ,5′-寡腺苷酸合成酶活性恢复正常 ,各腹膜透析组则持续降低 ;在腹膜透析时 ,各腹膜透析组均发生程度不等的间皮细胞脱落、腹膜增厚和急、慢性炎症细胞浸润 ;而Baxter组无急性炎症发生。随着停止腹膜透析时间延长 ,腹膜透析组病理改变逐渐修复。结论 :长期腹膜透析时 ,腹膜透析液对机体免疫功能均有长时间抑制 ,并造成不同程度的腹膜病理改变。腹透液的非生物相容性是导致机体免疫功能降低 ,腹膜损伤的重要因素。

慢性丙型肝炎患者（2＇，5＇）寡腺苷酸合成酶的活性测定

目的：了解慢性丙型肝炎患者（２＇，５＇）寡腺苷酸合成酶（２－５ＡＳ）活性在干扰素治疗过程中的动态变化及意义。方法：ＰＥＩ－ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ薄板层析法。结果：（１）慢性丙型肝炎患者２－５ＡＳ基础水平比正常人显著升高（Ｐ＜０．０１）；（２）ＩＦＮα治疗结束后ＨＣＶＲＮＡ持续阳性的病人２－５ＡＳ基础水平比ＨＣＶＲＮＡ转阴的病人要高（Ｐ＜０．０５）；（３）ＩＦＮα治疗效果较好，ＨＣＶＲＮＡ转阴的病人２－５ＡＳ水平在用药后２４ｈ比ＨＣＶＲＮＡ未转阴的病人上升得更高（Ｐ＜０．０１）；（４）用药后１个月２～５ＡＳ水平与ＩＦＮα治疗效果无显著相关性（Ｐ＞０．０５）。结论：２－５ＡＳ可以作为评价干扰素治疗效果的１个机体反应指标。

2',5'-寡腺苷酸合成酶基础活性对干扰素α治疗慢性丙型肝炎信号传导的影响机制研究

目的观察慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中2',5'-寡腺苷酸合成酶(2-5AS)基础活性对干扰素(IFN)信号分子改变的影响,探讨IFN-α治疗慢性丙型肝炎的作用机制。方法选择60例慢性丙型肝炎患者,抽取外周血分离出PBMC,每份标本进行2-5AS基础活性测定后分为实验组和对照组,对照组PBMC体外培养时不加IFN-α,实验组PBMC体外培养时加入IFN-α。培养24 h后,测定PBMC中2-5AS活性、IFN-α受体(IFN-αR)、信号传导及转录激活因子(Stat)1、Stat2、两面神激酶1(Jak1)和酪氨酸激酶2(Tyk2)等指标。结果实验组PBMC培养24 h后2-5AS活性、Jak1、Stat1、Stat2和Tyk2等表达明显增高(P<0.05),IFN-αR表达降低(P<0.05)。2-5AS基础活性与IFN-α刺激下PBMC中2-5AS、Tyk2和Stat1的表达呈负相关(P<0.05),而与IFN-αR、Jak1和Stat2的表达无相关性(P>0.05)。结论 2-5AS基础活性可下调PBMC对外源性IFN-α的敏感性,Stat1、Tyk2表达降低可能是下调机制发生的原因。

慢性肝病患者2′,5′-寡腺苷酸合成酶测定的临床研究

我们对1996年8月至1998年3月住院的40例慢性肝病患者外周血中的2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-AS)进行了测定,并与43例健康者进行对照,现报道如下。 1 材料与方法 1.1 临床资料 40例患者中,男33例,女7例,平均年龄35.76岁,平均病程7.86年。健康对照组43例(系健康体检者),其中男34例,女9例,平均年龄34.94岁。

HCV基因型与2′-5′寡腺苷酸合成酶活性的相关性研究

目的 了解丙型肝炎病毒基因型在不同人群中的分布规律与流行优势型及其与 2′ 5′寡腺苷酸合成酶 (2 5AS)的相关性。方法 分别对门诊体检、住院病人和血液透析患者抗 HCVIgG阳性标本 ,采用RT nested PCR方法检测HCVRNA ;用 5′端非编码区 (5′ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型 ;用PEI cellulose薄板层析法检测外周血单个核细胞的 2 5AS。结果 三组人群HCVRNA感染率分别为 1 .2 1 %、2 .6 6 %、38.84 % ;HCV基因型以 1b亚型为主 ,1b及 1b的相关型占 91 .6 7%。以ATP转化率表示 2 5AS活性水平 ,1b型和 1b相关的混合感染 2 5AS活性显著升高。而其他基因型与健康对照组无明显差别。结论 2 5AS活性的基础水平显著升高可能是HCV

中药复方对肝纤维化小鼠2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性影响和超微结构研究

目的:研究中药复方(二参泽术汤和丹参桃芎汤)防治肝纤维化时,对机体免疫功能的影响和肝细胞超微结构的改变。方法:制备小鼠肝纤维化模型;观察其病理组织学和超微结构,并测定2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性。结果:模型组肝细胞广泛脂肪样变性,汇管区大量胶原纤维增生。2′,5′-寡腺苷酸合成酶水平低下。二参泽术汤预防组肝组织超微结构基本正常,未见有胶原纤维增生;治疗组肝细胞间有少量胶原纤维增生。该药预防组和治疗组2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性显著高于模型组(P 均<0.01)。丹参桃芎汤预防组和治疗组有严重的细胞变性坏死,胶原纤维大量增生,2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性与对照组比较,有明显降低(P<0.01)。结论:在肝纤维化治疗时,机体免疫功能的高低与疗效有密切关系;二参泽术汤对提高肝纤维化小鼠机体的免疫功能和防治肝纤维化的效果均优于用丹参桃芎汤。2′,5′-寡腺苷酸合成酶的测定能反映肝纤维化的转归和预后。

2’5’寡腺苷酸-反义寡核苷酸体外抑制乙型肝炎病毒研究

乙型肝炎是目前最常见的病毒性传染病之一,但是慢性乙肝的治疗至今仍是难题.治疗原则包括抗病毒、免疫调节、改善肝功能、抗肝纤维化等.用抗病毒治疗来清除病毒是根本的治疗措施.反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,AS)对HBV具有一定的抑制效应.但AS的稳定性较差,极易降解.

慢性病毒性肝炎患者2′,5′-寡腺苷酸合成酶活性的测定及其意义

2′,5′-寡腺苷酸合成酶是干扰素在体内发挥抗病毒作用的一种干扰素调节蛋白,该酶活性的变化,可反应体内干扰素系统的状态,了解机体对干扰素治疗的反应.已有报道在病毒性肝炎患者中,测定2′,5′-寡腺苷酸合成酶的活性,可以了解机体的抗病毒状态.我们应用生物纸层析法测定慢性病毒性肝炎患者血中2′,5′-寡腺苷酸合成酶的活性,探讨该酶在病毒性肝炎患者中的活性变化及其意义.

猪寡腺苷酸合成酶OAS1a基因荧光定量SYBR Green检测方法的建立与运用

为建立一种可以有效检测猪寡腺苷酸合成酶OAS1a表达方法,为检测机体抗病毒免疫提供参考,设计猪寡腺苷酸合成酶OAS1a基因特异荧光定量引物,扩增后连接pMD18-T载体,构建标准质粒,倍比稀释生成标准曲线。结果表明,引物特异,无二聚体,扩增效果良好,运用该方法测定猪繁殖与呼吸综合征病毒感染巨噬细胞中以及干扰素和Poly(I∶C)刺激细胞过程中该基因表达以及在不同猪脏器组织中分布。结果表明,该基因在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染之后表达量逐步升高,36 h达到最高,干扰素及其诱导剂Poly(I∶C)刺激均可以提高该基因表达,组织分布结果表明,该基因在多种组织中都有分布,肝脏和淋巴结中分布较高。

慢性乙型肝炎2',5'—寡腺苷酸合成酶活性与干扰素疗效的关系

探讨慢性乙型病毒性肝炎患者血液中单个核细胞的 2 ',5 '—寡腺苷酸合成酶 (2 ',5 '-OAS)活性与干扰素疗效的关系 ,为临床预测干扰素疗效 ,避免盲目使用干扰素提供依据。将 17例HBeAg、HBV -DNA双阳性的慢乙肝患者干扰素治前、治疗一周及治疗三月后进行 2 ',5 '-OAS检测。结果示 11例治前 2 ',5 '-OAS活性较低 ,治疗一周有明显升高。其中 8例HBeAg、HBV -DNA双项转阴。 3例HBeAg单项转阴。其余 6例治疗前 2 ',5 '-OAS活性较高 ,治后 1周升高幅度不大 ,双项均无转阴。提示 2 ',5 '-OAS的水平可能是临床预测干扰素疗效的指标之一。

2',5'-寡腺苷酸合成酶1基因多态性与自发性早产和胎膜早破易感性的病例对照研究

目的探讨2',5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)基因多态性和自发性早产和胎膜早破易感性的关系。方法收集自发性早产儿599例作为病例组,其中包括胎膜早破171例;孕母无自发性早产和胎膜早破病史的673例足月儿作为对照组。采用病例-对照研究,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析检测OAS1内含子区rs10774671位点的单核苷酸多态性。结果病例组和对照组两组间OAS1 rs10774671基因型AA、GA、GG以及等位基因A、G的频率之间的差异均无统计学意义;有无胎膜早破病例组分别和对照组比较,上述频率之间的差异均无统计学意义;不同胎龄的自发性早产亚组分别和对照组比较,上述频率之间的差异均无统计学意义。结论 OAS1基因多态性与自发性早产和胎膜早破易感性之间缺乏关联。

猪2′,5′寡腺苷酸合成酶OAS1a基因克隆与序列分析及其在Marc-145细胞上对PRRSV复制的影响

旨在探索猪2’，5’寡腺苷酸合成酶OASla对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRs）的复制是否有抑制作用，进而为探索抑制病毒复制寻求新的思路。从PAM猪肺泡巨噬细胞中克隆了猪2’，5‘寡腺苷酸合成酶OASln基因，将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，测序与序列分析之后将该基因转染Marc-145细胞，然后接种PRRSV病毒，与对照组比较病毒的抑制效果。结果显示，病毒的滴度明显下降，病毒的RNA水平也明显下降，由此推断猪2’，5，寡腺苷酸合成酶OAS1a可以在Marc-145细胞上抑制PRRS的复制。

2′-5′寡腺苷酸合成酶1基因多态性与乙型肝炎病毒易感性和抗病毒疗效的相关性

人体感染HBV后,可自身清除病毒或持续性感染,在成人感染者中有5%～10%不能清除病毒,导致慢性病毒携带状态。其造成肝损伤的程度不一,发展为肝硬化或肝癌进程不一、药物治疗的反应个体差异亦很大,宿主的遗传因素对乙型肝炎的这些临床转归起了关键作用。目前干扰素诱导抗病毒基因2′-5′寡腺苷酸合成酶1（OAS1）与HBV易感性和抗病毒疗效的相关性研究鲜见报道，