寡霉素A增加结直肠癌HT29细胞放射治疗抵抗及其机制

目的:放射治疗(以下简称放疗)是结直肠癌治疗的主要手段之一,但放疗抵抗往往导致治疗失败。为了改善放疗抵抗,本研究探索H+-ATP合酶抑制剂寡霉素A对结直肠癌HT29细胞放疗敏感性的影响及其机制。方法:采用MTT和糖酵解实验检测不同浓度的寡霉素A在不同时间点对结直肠癌HT29细胞存活率和糖酵解的影响。在体外合成siRNA-PFK1并将之转染到HT29细胞中,采用MTT和克隆形成实验检测寡霉素A对结直肠癌细胞放射敏感性的作用;采用蛋白质印迹法检测寡霉素A对糖酵解酶磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1,PFK1)表达的影响,比较单纯siRNA-PFK1转染和寡霉素A联合siRNA-PFK1转染对细胞生存和糖酵解的影响。用4 Gy X线照射后,对比寡霉素A联合siRNA-PFK1转染与单纯siRNA-PFK1转染对细胞生存的影响。结果:与0μmol/L寡霉素A组比较,4μmol/L寡霉素A处理的HT29细胞存活率显著增高(P<0.05),细胞/葡萄糖摄取及乳酸和ATP的产生显著增加(均P<0.01)。给予不同剂量(0,2,4,6和8 Gy)的X线照射后,4μmol/L寡霉素A组的克隆形成率及细胞存活率均较0μmol/L寡霉素A组显著增高(均P<0.01)。计算得出寡霉素A对HT29细胞的放射增敏比为0.4886。4μmol/L寡霉素A处理组细胞PFK1的表达水平较0μmol/L寡霉素A组明显升高(P<0.001)。与正常对照组比较,糖酵解水平、克隆形成率、细胞存活率均在HT29细胞转染siRNA-PFK1后降低(均P<0.05),而寡霉素A联合siRNA-PFK1转染组均较siRNA-PFK1组升高(P<0.001)。用4 Gy X线照射后,siRNA-PFK1转染组与单纯照射组比较,克隆形成率和细胞存活率降低(P<0.01或P<0.001),而在寡霉素A联合siRNA-PFK1转染组均较siRNA-PFK1转染组升高(均P<0.001)。结论:寡霉素A可增加结直肠癌HT29细胞放疗抵抗,其机制可能与上调PFK1表达、增强糖酵解有关。

寡霉素敏感性赋予蛋白的研究进展

线粒体F1Fo ATP酶寡霉素敏感性赋予蛋白(oligomycin sensitivity-conferring protein,OSCP)是质子转运、ATP合成耦合以及维持线粒体呼吸链稳定的关键蛋白。OSCP位于线粒体ATP合酶催化F1区顶部,与F1和外周茎稳定接触,以确保Fo与F1之间的结构稳定和功能偶联,然而这种偶联可被抗生素寡霉素破坏。亲环蛋白D(Cyclophilin D,CypD)是一种表征良好的线粒体通透性过渡孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)诱导剂,诱导mPTP打开,导致细胞死亡。研究表明,OSCP与亲环蛋白存在结合靶点,两者相互作用可影响ATP合成酶活性,降低打开mPTP所需的基础Ca2+阈值,导致线粒体内Ca2+浓度增加,诱发线粒体功能障碍。作为线粒体F1Fo ATP酶上的关键蛋白,OSCP通过与其他蛋白相互作用,参与调控线粒体功能和稳定,深入研究OSCP有助于推动线粒体疾病治疗的进展。本文综述了OSCP的定位、结构和功能,以及目前靶向OSCP对治疗各类疾病的研究进展,为治疗线粒体功能障碍引发的疾病提供新思路。

藤黄灰链霉菌ECO 00001菌株中寡霉素A和C的分离鉴定及其活性

运用生物活性追踪和色谱分离方法,从藤黄灰链霉菌ECO 00001菌丝体丙酮粗提物中分离得到两个活性化合物。经波谱分析,鉴定为大环内酯类抗生素寡霉素C和A。采用孢子萌发抑制法和菌丝生长抑制法测定寡霉素C和A对5种植物病原真菌的离体抗菌活性。当寡霉素C和A的浓度分别为15μg/mL和5μg/mL时,对百合灰霉病菌、百合炭疽病菌、烟草赤星病菌、稻瘟病菌及水稻恶苗病菌的孢子萌发抑制率均为100%;当浓度分别为100μg/mL和50μg/mL时,对上述5种病原真菌的抑菌圈直径均在10mm以上,化合物II对5个供试植物病原真菌的抑制活性强于化合物I。

寡霉素的研究进展

寡霉素抗生素组合物是一类二十六元环大环内酯类抗生素,具有强烈的抗肿瘤、抗真菌、呼吸抑制作用及杀虫等生物学活性,被广泛应用于科学研究当中。本文对寡霉素的生物学活性、产生菌及生物合成的研究进展进行了综述。

大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因的体外扩增及克隆

目的 构建大鼠寡霉素敏感相关蛋白 (OSCP)基因重组质粒。方法 从雌性SD大鼠脑组织中提取总RNA ,根据OSCP基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,用PCR方法扩增编码OSCP的基因片段 ,插入pGEM Teasy质粒 ,转化大肠杆菌JM1 0 9感受态细胞 ,经酶切鉴定 ,而后进行测序。结果 OSCP基因体外扩增产物大小为 70 0bp ,重组质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内初次克隆了大鼠OSCP基因 。

线粒体ATP合酶中寡霉素敏感相关蛋白的研究进展

目的阐述线粒体ATP合酶中寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的位置、结构、功能及其在药理学中作为分子靶点的研究。方法根据近年文献资料对寡霉素敏感相关蛋白的位置、结构、功能及其作为分子靶点的研究进行综述。结果与结论寡霉素敏感相关蛋白位置、结构及功能方面的阐述是其作为分子靶点方面研究的基础,分子靶点的研究将成为分子治疗学的一个新关注点。

密旋链霉菌Act12中调控因子AdpA-s和LuxR-2306对寡霉素合成的影响

为揭示密旋链霉菌Act12(Streptomycespactum)中全局调控因子AdpA-s和途径特异调控因子LuxR-2306对寡霉素合成的影响,构建了AdpA-s和LuxR-2306的阻断突变株和高表达菌株,采用滤纸片法检验了发酵液对苹果腐烂菌(Valsamali)的抑生活性,利用高效液相色谱法(HPLC)分析了寡霉素的产量,通过定量PCR分析AdpA-s、LuxR-2306转录水平与寡霉素合成之间的关系.结果表明:高表达突变株AdpA-s HE和LuxR-2306 HE对苹果腐烂菌的抑生能力显著增强;而基因阻断突变株Spa LuxR-2306不再对苹果腐烂菌的生长具有抑制效果.AdpA-s HE和LuxR-2306 HE发酵液中寡霉素产量分别提高了1.8和1.9倍;Spa LuxR-2306中完全检测不到寡霉素的存在.实时定量PCR结果表明,LuxR-2306的转录水平与寡霉素生物合成核心酶的转录水平呈显著正相关.AdpA-s高表达突变株中LuxR-2306的转录水平也得到了显著提高.以上结果表明:LuxR-2306为寡霉素生物合成的途径特异性正调控因子,可以通过正调控寡霉素生物合成基因簇中核心酶的转录,进而促进寡霉素的合成.而全局性调控因子AdpA-s可能通过对LuxR-2306的转录调控,间接影响寡霉素的生物合成,后续实验将对此展开进一步的深入研究.此研究为后续对生防菌Act12中次级代谢的调控研究提供了一定的理论基础.

大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因的改造及在大肠杆菌中的表达

目的通过将发生点突变的两个大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因进行改造,获得具有正确序列的OSCP基因,在大肠杆菌中表达并进行活性鉴定。方法通过限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶将发生错义突变的两个OSCP基因的DNA克隆进行改造,获得具有正确核苷酸序列的OSCP基因;然后将该片段连接进原核表达载体pET-28c(+),构建成重组质粒PET-28c(+)-OSCP;用该重组质粒转化E.coli,转化子在37℃诱导表达相应的融合蛋白,通过Western-blot鉴定。结果酶切及测序显示对OSCP基因错义突变的纠正获得成功。酶切结果显示成功构建了原核表达载体pET-28c(+)-OSCP。IPTG诱导表达4h后,SDS-PAGE及Western-blot显示诱导表达出分子量约23000的大鼠寡霉素敏感相关蛋白,且该蛋白具有免疫活性。结论在国内初次表达出大鼠OSCP,表达产物具有免疫反应性,为OSCP的结构及功能研究奠定了基础。

寡霉素处理下细胞外ATP和细胞内ATP的关系及其对细胞死亡调节作用的研究

以烟草悬浮细胞BY^(-2)为材料,利用FoF1-ATP合成酶(FoF1-ATPase)抑制剂寡霉素研究了细胞内ATP(i ATP)对胞外ATP(e ATP)水平的影响,以及施加外源ATP对i ATP水平和细胞死亡的调节作用。结果表明,随着寡霉素浓度的增加(5、10、25、50μmol·L^(-1)),烟草悬浮细胞的i ATP含量逐渐下降,e ATP含量也随之减少,且细胞死亡水平在较高寡霉素处理浓度下有明显上升。同时,随着寡霉素处理时间的增加(0.5、1、3、5 h),烟草悬浮细胞的i ATP含量和e ATP含量也呈现出不同程度的下降,而细胞死亡水平则有所增加。施加外源ATP能够缓解寡霉素引起的细胞i ATP水平的下降和细胞死亡水平的上升。上述结果表明,e ATP水平受到了i ATP水平的影响,而e ATP也在线粒体ATP合成受到抑制时调控i ATP和细胞死亡的发生。

大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因点突变的改造

目的获取具有正确核苷酸序列的大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因。方法通过限制性核酸内切酶将发生有义突变的两个OSCP基因的DNA克隆进行改造,并进行基因重组。结果酶切及测序显示对OSCP基因有义突变部分的纠正获得成功。结论通过基因工程技术获得具有正确核苷酸序列的大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因,为OSCP的表达及结构功能研究奠定了基础。

大鼠寡霉素敏感相关蛋白原核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因全长cDNA,构建原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织中扩增出目的基因,先以A-T连接方式克隆到pTA2载体中,再将其克隆到原核表达载体pQE30-Xa中,并进行酶切、测序鉴定。结果:RT-PCR扩增出约700bp特异性片段,重组原核表达载体经酶切鉴定结果同预期相符,经测序鉴定序列同源性与GeneBank报道一致。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。

寡霉素在叶绿体中的作用部位

寡霉索可抑制光下DTT激活的Mg^(2+)-ATP酶活力并促进质子流出,这两种效应对温度的反应相似,并受膜能化状态的影响。 寡霉素对在光下以胰蛋白酶激活的叶绿体膜上Mg^(2+)-ATPase和脱离了膜的Ca^(2+)-ATPase都有抑制作用,但对经NEM修饰的叶绿体膜上Mg^(2+)-ATPase活力没有影响,且其促进质子流出的效应也消失,在暗中经胰蛋白酶活化的Ca^(2+)-ATPase对寡霉素不敏感。由此推断寡霉素抑制光激活的ATPase和促进质子流出的效应是光引起膜能化导致CF_1变构,γ亚基暴露,而使寡霉素能与之结合的结果,因此寡霉素在叶绿体上的作用部位是在CF_1中,而与线粒体在F_0上有所不同。

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。

三苯基锡、二环己基碳二亚胺和寡霉素在叶绿体中的作用特点

作用于质子通道的抑制剂(TPT,DCCD和OM)对与叶绿体中质子跨膜传导失去联系的甲醇活化的类囊体膜上或离体的CF1—ATP酶活性无抑制作用,其主要作用部位在质子通道CF_0上。TPT和 DCCD能恢复残缺膜积贮H_in^+、重建△pH和△ψ,使其电子流从解联状态回到复与叶绿体基础电子流相一致的水平。低浓度TPT即可部分恢复残缺膜的DLE,而DCCD需较高的浓度。低浓度TPT对叶绿体DLE有明显促进作用,而高浓度TPT和 DCCD有抑制作用。OM对这些功能都没有明显影响。推测OM可能作用于CF_0与CF_1的连接处,TPT的作用部位可能与光系统Ⅱ的水氧化质子释放部位有联系。

基于代谢组学研究TetR家族转录因子SPA7074对密旋链霉菌Act12代谢的影响

为了阐明TetR家族转录因子SPA7074影响密旋链霉菌Act12的具体机制,利用超高效液相色谱-质谱联用的非靶向代谢组学方法,检测了SPA7074缺失突变株(Δspa7074)与野生型Act12之间的胞内代谢物图谱,并进行多元筛选统计分析。结果表明:在正离子模式下Δspa7074中相较于野生型显著差异代谢物共有55种,为氨基酸及其衍生物、核黄素、S腺苷甲硫氨酸和低碳有机酸等物质,这些化合物多为寡霉素等大环内酯类抗生素生物合成的前体或中间产物,以及能量代谢相关物质;通过胞内相关的次级代谢中间产物的结构分析,对寡霉素的生物合成途径进行了初步的阐述。以上结果说明SPA7074敲除后胞内寡霉素生物的合成显著提高并及时转运出胞外,消耗了大量的氨基酸代谢相关产物,增加了细胞的能量供应,改变了胞内的代谢流。

阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建

以仅产阿维菌素(avermectin)B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株,构建基因缺失载体pXL05(pKC1139::△olmAl+△olmA4),并将其转入CZ8-73中,通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换,对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变.将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测,发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分,阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当,说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成.该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的,不会发生进一步的重组,因此突变株性状稳定,在工业生产上具有应用价值.

硼替佐米联合有氧氧化抑制剂寡霉素靶向Burkitt淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用及机制

目的 :研究硼替佐米(bortezomib,BTZ)联合寡霉素(oligomycin,OM)对Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖及凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法:采用不同浓度的BTZ(0、5、10、15、20、25和30 nmol/L)单药或联合OM(0.05μg/m L)作用于Raji细胞,CCK-8法检测对细胞增殖抑制率的影响;实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测原癌基因C-myc、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及其靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和葡萄糖转运体1(glucose transporter 1,GLUT1)m RNA及蛋白的表达,以及代谢途径中关键酶己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ,HKⅡ)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDHA)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDHA)m RNA及蛋白表达水平的变化;葡萄糖检测试剂盒[己糖激酶(hexokinase,HK)法]和乳酸检测试剂盒分别检测Raji细胞培养液中葡萄糖和乳酸浓度的改变;FCM法检测细胞周期分布及细胞凋亡的改变。结果 :不同浓度的BTZ单药作用于Raji细胞后,可明显抑制Raji细胞的增殖且呈剂量依赖性(P值均<0.01)。BTZ(5、10、15和20 nmol/L)联合OM对Raji细胞的增殖抑制率显著高于BTZ单药组(P值均<0.01)。BTZ单药作用于Raji细胞后,可不同程度抑制细胞中C-myc、HIF-1α、VEGF、GLUT1、HKⅡ、LDHA及SDHA m RNA及蛋白的表达;联合OM处理Raji细胞后,代谢相关基因m RNA及蛋白的表达水平进一步下调(P值均<0.05)。联合用药组抑制葡萄糖消耗及糖酵解代谢产物乳酸生成的能力明显高于BTZ单药组(P值均<0.05)。BTZ单药组能明显促进Raji细胞的凋亡且呈剂量依赖性,BTZ浓度为25 nmol/L时,Raji细胞主要被阻滞于G2/M期;而联合用药组能进一步提高细胞的凋亡率,BTZ浓度为5和15 nmol/L时,Raji细胞主要被阻滞于G0/G1期。结论 :BTZ可抑制Raji细胞的糖酵解通路,联合OM可协同增强这一抑制作用,这种协同机制可能与2种药物联用后,可同时抑制糖酵解及有氧氧化这2条代谢途径有关,提示抑制双代谢途径可能成为治疗Burkitt淋巴瘤的新选择。

南昌链霉菌代谢产物与代谢工程研究现状的回顾与展望

南昌链霉菌是从江西农业大学校园油茶根际土壤中分离筛选到的一株链霉菌新种,它至少可以产生两种具有重要应用和基础研究价值的抗生素——南昌霉素和梅岭霉素。在国家自然科学基金、国家科技攻关计划、上海市科委的资助下,对这一链霉菌新种进行了多年全面系统的研究,本文对此进行了全面的回顾,并对后续研究进行展望。

植物内生阿维链霉菌I06A-01716次生代谢产物的研究

目的分离鉴定阿维链霉菌I06A-01716发酵液中抗植物病原真菌活性成分,并进行抗真菌、抗肿瘤和免疫抑制活性研究。方法在抗真菌活性指导下,采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC等分离手段对活性组分进行分离;通过高分辨质谱,1D-NMR和2D-NMR对其结构进行鉴定;采用琼脂平板纸片法,进行抗植物病原真菌的最低抑制浓度测定;采用MTT法检测其对肿瘤细胞生长的抑制作用;采用流式细胞仪测定其对细胞周期的影响。结果分离得到2个活性组分:1716-1和1716-2。1716-1和1716-2对人肝癌细胞HepG2的IC50值分别为2.42μg/mL和3.42μg/mL;对人口腔上皮癌细胞KB的IC50值分别为1.64μg/mL和6.73μg/mL。细胞周期研究表明,随着1716-2的浓度增加,在KB细胞中,G2/M期比例由对照组的15.23%逐步升高到36.53%;在HepG2细胞中,G2/M期比例由对照组的4.39%升高到35.78%。结论1716-1和1716-2结构分别与寡霉素B和寡霉素A一致。1716-1和1716-2有抗多种植物病原真菌活性。1716-1和1716-2在较低浓度下能够抑制人肝癌细胞HepG2和人口腔上皮癌细胞KB生长。1716-2使HepG2细胞和KB细胞阻滞在G2/M期。

寡霉素对白血病K562/A02细胞株凋亡调控机制探讨

目的寡霉素是一种线粒体F0F1-ATP酶抑制剂,能抑制细胞内能量的产生。目前尚无寡霉素对白血病多药耐药细胞株K562/A02作用的报道。本研究旨在探讨线粒体靶向药物寡霉素对白血病多药耐药细胞株K562/A02的体外促凋亡作用。方法四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoyl tetrazolium,MTT)法进行寡霉素的细胞生长抑制试验。流式细胞术检测寡霉素作用后早期细胞凋亡率,线粒体膜电位的变化及细胞内活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的水平。结果寡霉素对K562/A02和K562细胞具有生长抑制作用,且具有浓度依赖性,IC50值分别为(11.24±1.27)μg/mL和(42.66±3.39)μg/mL,K562/A02对寡霉素的敏感性高于K562细胞,差异有统计学意义,t=15.03,P<0.01。寡霉素可诱导细胞的凋亡,25μg/mL寡霉素作用24h后K562/A02和K562细胞的早期凋亡率分别为(8.20±0.48)%和(3.28±0.37)%,差异有统计学意,t=14.06,P<0.01。25μg/mL寡霉素作用24h后K562/A02和K562细胞均出现线粒体膜电位的下降,分布在去极化区域细胞的比例分别为(17.08±2.63)%和(8.75±1.96)%,差异有统计学意义,t=4.40,P=0.01。25μg/mL寡霉素作用24h后K562/A02和K562细胞内活化Caspase-3的水平分别为94.21±7.27和46.76±5.71,均高于对照组的2.87±0.86,差异均有统计学意义,t值分别21.61和13.16,均P<0.01。K562/A02和K562细胞内活化Caspase-9水平分别为67.89±5.78和40.24±4.56,均高于对照组的3.07±0.39,差异均有统计学意义,t值分别为19.38和14.07,均P<0.01。而寡霉素作用后K562/A02和K562细胞内活化Caspase-8的水平分别为2.56±0.45和2.17±0.45,与对照组(2.38±0.79)比较差异无统计学意义,t值分别为0.34和0.40,均P>0.05。结论寡霉素通过线粒体途径诱导K562/A02细胞的凋亡。