对环境因素敏感的荧光探针的研究进展

生命体系中各种环境因素（极性、pH、粘度、温度等）的改变在生理、病理过程中扮演着重要的角色。如，蛋白酶局部极性的改变可以影响蛋白质的内部静电相互作用、以及蛋白与各种配体之间的作用强度；细胞中pH值的改变会导致心肺或神经性疾病，严重时甚至会危及生命；粘度的改变与动脉硬化、高胆固醇症等疾病密切相关；病态细胞由于其代谢活动的增加而比正常的细胞温度高。因此，发展能及时反映环境因素变化的原位传感与分析方法，对相关疾病的早期诊断与病理研究、进而揭示其分子发病机制则具有重要的作用。

开发用于肿瘤微环境成像的pH敏感荧光探针

目的·合成水溶性pH响应性花菁类近红外荧光探针,评估其光学性能,并将其应用于模拟肿瘤微环境的在体成像。方法·应用两步经典的化学反应,合成水溶性pH响应性近红外荧光探针R2S,同步合成脂溶性探针R2Z作为对照。应用磁共振氢谱、质谱及高效液相色谱验证探针的化学结构及纯度。利用紫外-可见、光致发光光谱学测试评价探针的pH响应性、响应可逆性、光稳定性及结构稳定性。利用细胞荧光共定位成像评价探针的细胞膜通透性,使用HCT-116细胞、HeLa细胞进行细胞毒性实验,使用BALB/c健康雌性小鼠进行小动物在体成像实验,评估探针的安全性。通过在小鼠背部左侧和右侧分别皮下注射pH 6.50和pH 7.40的PBS溶液模拟肿瘤微酸性环境和正常的细胞环境,随后注射探针R2S进行在体成像实验,比较R2S在pH 6.50侧和pH 7.40侧的荧光强度。结果·成功合成了水溶性pH响应性近红外荧光探针R2S及其脂溶性类似物R2Z。随着溶液酸性逐渐增强(从pH 11.10到pH 3.47),R2S的最大吸收波长由642 nm红移至774 nm,最大发射波长亦由794 nm红移至808 nm。探针R2S的酸解离常数(p Ka)值约为6.88。与脂溶性探针R2Z相比,R2S在保留了较好细胞膜通透性的前提下,展现出更大的斯托克斯位移、更好的响应可逆性、更高的稳定性。R2Z在12.5μmol/L浓度下,细胞相对存活率低于80%;而R2S在100μmol/L浓度下,仍未表现出明显的细胞生长抑制现象,表明其具有更高的生物安全性。R2S在模拟肿瘤微酸性环境的低pH组织和正常pH组织中的成像具有明显的区分度。结论·水溶性pH响应性花菁类近红外荧光探针R2S对pH变化响应灵敏、稳定,最佳响应范围与肿瘤所处微环境的pH相符,在肿瘤成像领域展现出了较强的在体成像应用潜力。

CdTe量子点酸度敏感荧光探针测定水样中铵根离子含量

本研究在水相中合成了高质量的巯基乙酸包被的CdTe量子点。在pH5.8～8.0范围内的PBS缓冲溶液中,CdTe量子点荧光强度与体系酸度存在良好的线性关系。利用NH4+对量子点荧光的猝灭作用,实现了对水溶液中NH4+的定量检测。在最优条件下,CdTe量子点酸度敏感探针荧光的猝灭程度与NH4+浓度呈良好的线性关系,线性范围为0.05～6.0mmol/L,检出限为0.15μmol/L。对1.0mmol/L标准溶液平行测定11次,相对标准偏差为3.2%。利用标准加入法对水样中NH4+含量进行了测定,其结果与蒸馏-酸滴定法的结果基本一致。

荧光共振能量转移电压敏感探针在钾通道抑制剂高通量筛选中的应用

目的:建立以荧光共振能量转移(FRET)电压敏感探针为染料的钾通道抑制剂高通量筛选模型。方法:分别用电压敏感探针的能量供体CC2-DMPE与能量受体DiSBAC2(3)先后负载RBL-2H3细胞,测量细胞去极化前后460nm和570nm的荧光变化,根据荧光的变化反映细胞膜电压的变化。结果:本筛选方法稳定可靠,系统Z’因子达到0.60以上,日筛选通量能够达到10000药次。对102个定向合成的化合物进行筛选,有11个化合物的荧光信号变化率有较好的剂量效应关系。结论:此模型具有良好的稳定性和特异性,FRET电压敏感探针是钾通道抑制剂高通量筛选的理想染料。

基于荧光猝灭原理的光纤化学传感器研究 Ⅱ.比较五种分子探针制成敏感膜的动力学猝灭性质

将芘、芘丁酸、对硝基苯芘丁酸酯、罗丹明123和乙二胺基萘磺酸钠等分子探针分别加入适当的固相支持剂和增塑稳定剂,制成五种敏感膜。测定了Cr^(3+)、I^-、甲硝唑和氯霉素等猝灭剂对各种敏感膜的动力学猝灭响应数据。实验结果显示分子探针的化学结构、电荷或取代基不同使敏感膜对猝灭剂有不同的选择性和灵敏度。

基于双荧光敏感团策略的Hg^2＋高分辨比率型生物成像探针

汞离子具有极大的生物和环境毒性（即使在很低的浓度下），因此设计合成用于测定Hg^2＋的荧光探针是分析研究领域的热点。大部分Hg^2＋荧光探针都是基于单波长变化的，这样的测量过程会受一些因素如光漂白、探针分子的浓度、微环境和光照射下探针分子的稳定性等的影响，比率型荧光探针可克服上述因素的影响，并有利于增加响应范围。

pH敏感的荧光探针及在活细胞中的应用

细胞内的pH是细胞内多种酶活性和生理活动的重要调节因素,准确、动态的监测细胞内pH变化对研究细胞内的活动至关重要。一些荧光小分子可以感应pH的变化,同时具有较高的灵敏度和特异性,对细胞损伤较小且标记操作简单,已逐渐发展成为一种监测细胞内pH变化的有效方法。本文主要介绍目前常用pH敏感的荧光探针及其在活细胞研究中的进展。

pH和温度敏感型聚合物荧光探针的合成及应用

以萘酰亚胺(NI)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和多面体齐聚倍半硅氧烷(POSS)为原料,通过可逆加成断裂自由基聚合(RAFT)方法,设计合成了具有p H响应和温度敏感的聚合物荧光探针Poly(POSS-NINIPAM)。通过核磁共振波谱仪(NMR)、荧光发射光谱仪和质谱仪(MS)等技术手段表征了Poly(POSS-NINIPAM)的p H和温度的响应性能。结果表明,在p H值5.8~8.0范围内,探针Poly(POSS-NI-NIPAM)的荧光强度变化明显,与p H值呈现良好的线性相关(λem=520 nm,p Ka=6.51),对p H和温度的响应均呈现出良好的循环检测性能,可用于检测活细胞He La的p H值变化。探针Poly(POSS-NI-NIPAM)在检测生物样本中p H/温度变化方面具有潜在的应用前景。

pH和温度敏感型聚合物荧光探针的合成及应用

本研究目的是探究pH和温度敏感型聚合物荧光探针的合成及应用。采用将萘酰亚胺(NI)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、多面体齐聚倍半硅氧烷(POSS)为原料,经由可逆加成断裂自由基聚合(RAFT)方法,设计合成具有pH响应与温度敏感的聚合物荧光探针poly(POSS-NI-NIPAM)。经由核磁共振波谱仪(NMR)、银光发射光谱仪(MS)表征poly(POSS-NI-NIPAM)的pH与温度相应性能。紫外-可见吸收光谱显示,在pH从10.0到2.2过程中,Poly最大吸收波长轻微篮移,且在200nm部位出现等吸收点。聚合物体系Poly在520nm位置荧光在温度的不断升高下而有所降低;探针在pH值变化(4.22/10.09)与温度变化(20～40℃)时,Poly荧光强度可逆循环性能良好。结论是Poly适合成为聚合物荧光传感器检测pH/温度变化的材料,在生物样本p H/温度变化检测中具有较大的应用价值。

对生物环境因素敏感的荧光探针

生物体中微环境的改变与许多生理、病理过程密切相关。因此,获取生物体系中局部环境信息、监控微环境的改变,对相关疾病的早期诊断与病理研究具有重要的意义。荧光探针由于具有分析灵敏度高、样品时空分辨能力强等特点,已在该方面获得了广泛的应用。根据不同的环境敏感性,本文简要评述对极性、pH、黏度及温度因素敏感的荧光探针及其在生命科学领域应用的研究进展,包括我们实验室近年来在该方面所取得的一些研究结果。

兔出血症病毒2型TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

以新发生的兔出血症病毒2型(RHDV2)SC 2020/04株VP60基因序列为参考,设计出1对特异性引物和TaqMan探针,建立了一种快速、灵敏且特异的用于检测新型病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示:本研究建立的方法,标准曲线线性关系良好,R^(2)值达到0.999;其特异性较好,与兔出血症病毒1型(RHDV1)、仙台病毒(SV)和轮状病毒(RRV)病原均无交叉反应;灵敏性高,最低检出量为1μl 1×10拷贝;且重复性良好,批内和批间试验的变异系数平均值均小于2%。临床检测结果表明,利用该方法对108份临床病料进行检测,检出RHDV2阳性样品72份,检出率为66.7%,明显高于常规的RT-PCR方法(62.0%)。结果证明,新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法适合于RHDV2感染的特异性诊断。

靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针检测人肝癌HepG2细胞线粒体ROS水平动态变化

目的通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础。方法采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定。将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况。将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与Mito Tracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位。取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢(H_2O_2)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片。结果成功构建p LentiCMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体。制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×10~8 IU/mL。mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞。外源性氧化剂H_2O_2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值(405 nm/488 nm)从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25。结论靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像。

CdTe量子点作为pH敏感探针测定抗坏血酸的研究

量子点凭借其优异的物理和化学性能引起了人们广泛的关注。近年来由于其表面化学研究的逐步深入，已经广泛地应用于新型荧光探针。量子点的发光性能与其表面状态密切相关，表面化学的观点认为，所有的淬灭作用都是由量子点的表面状态的改变而引起的。本项研究利用水热法制备了TGA修饰的CdTe量子点，利用透射电子显微镜、吸收光谱和荧光光谱对所合成的量子点进行了表征，并以CdTe量子点作为pH敏感的探针，

微生物检测用新一代DNA荧光探针检测仪

本文介绍了新一代DNA荧光探针检测仪,其原理为链置换扩增技术。该仪器在微生物检测中敏感、特异、快速,每日可检测500份以上样品,自动化程度高,操作简便,减少了污染。

新型BODIPY荧光探针荧光性质的研究

以我们自己合成的BODIPY酯为研究对象,研究了溶液中有机溶剂的含量、溶液的pH值、光照以及温度四种因素对荧光性质的影响,结果表明:当甲醇和乙腈含量分别为80%和70%时,BODIPY酯荧光强度最强;当pH=11.0时,荧光强度达到最大值;在同一温度下,随着时间的延长,荧光强度基本上没有明显的变化;BODIPY酯具有很好的光稳定性。

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV(A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群)的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe(5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)和CIAV-Probe(5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×ReactionMix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP(工作浓度40.0μmol/L)各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3(工作浓度5.0μmol/L)各0.4μL,ALV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.4μL,CIAV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.8μL,以ddH_(2)O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

离体培养细胞系冷休克敏感差异性的研究

应用台盼蓝活体染色方法、Hoechst332 5 8荧光探针技术研究低温冷休克 (4℃ )对人肝癌细胞系 (74 0 2 )、秋行军虫细胞系 (Sf9)、幼蚊细胞系 (C6 36 )及草鱼肾细胞系 (CIK)的影响。结果显示 :在冷休克处理 6天后 ,Sf9、C6 36、CIK、74 0 2细胞系的死亡率分别是 2 0 .0 3%、10 0 %、2 8.6 9%、10 0 % ;凋亡率分别为 2 .4 5 %、38.38%、8.2 5 %、96 .4 7% ,其细胞的死亡率远远大于凋亡率。可见冷休克导致细胞死亡过程中 ,应是细胞坏死和凋亡并存。但就其细胞凋亡的敏感性而言 ,4种细胞顺序应为 74 0 2 >C6 36 >CIK >Sf9。研究结果为在细胞水平、分子水平深入研究低体温生物离体细胞冷休克机理奠定基础。

高分子基质和光学-氧压敏感涂料性能的关系

基于氧对荧光的淬灭作用,由荧光探针和高分子基质组成的氧压敏感涂料(PSP),是用于风洞测量空气动力学模型表面空气压力分布的新型压力传感器.研究荧光探针和高分子基质对PSP压力灵敏度的影响,可以为提高压力传感器的测量精度提供向导.实验将聚甲基苯基硅氧烷、三氟氯乙烯-醋酸乙烯酯、聚二甲基硅氧烷和聚甲基氟丙基硅氧烷分别与芘丁酸(PYB)和N,N,N’,N’-四甲苯基联苯胺(TBD)两种荧光探针共混,观察其荧光发射的氧猝灭作用.结果表明,PYB在上述聚合物中的氧猝灭灵敏度和响应时间随聚合物的透氧性而变化,属于扩散控制机理;在氮-氧转换时荧光猝灭时间响应也与聚合物的氧透过率一致;而TBD与4种聚合物的相互作用导致荧光发射光谱不同程度的位移,即TBD/聚合物体系的氧猝灭灵敏度与探针-聚合物的相互作用相关,而聚合物的氧透过率影响不明显.

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2.1基因(yellowcameleon2.1)导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器(房室化现象),所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。

用于牛肉掺杂肉成分检测的荧光PCR方法研究

目的:研究用于牛肉掺杂肉成分检测的荧光PCR方法。方法:制备不同混合比例的牛肉、猪肉、鸭肉样品,采用DNA提取方法分别提取牛肉、猪肉、鸭肉的DNA,并以不同源性基因为靶基因设定特异性引物和探针;利用荧光PCR的反应条件对DNA实施扩增,分析不同掺杂比例的混合肉样品。结果:该方法设计的荧光PCR引物和探针具备良好的特异性和敏感性,可有效检测出相同质量牛肉、猪肉、鸭肉的DNA浓度差异,可检测出牛肉中猪源性成分、鸭源性成分的质量百分比,且误差均在5%以内,同时可检测实际牛肉食品中牛源性含量差异,并通过DNA检测条带清楚呈现。结论:该方法具备牛肉中掺杂肉成分检测的有效性。