对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

原子转移自由基聚合制备新型接枝聚α-D-吡喃半乳糖苷色谱固定相及其性能

以2-溴异丁酰溴为引发剂,CuCl/CuCl2/Me6TREN为催化体系,在室温条件下采用原子转移自由基聚合(ATRP)法将单体6-O-甲基丙烯酰基-1,2,3,4-双-O-亚异丙基-α-D-吡喃半乳糖苷(6-O-methacryloyl-1,2,3,4-di-O-isopropylidene-α-D-galactopyranose,MAIPGal)接枝到5μm大孔硅胶表面上,得到了新型接枝聚合物(pMAIPGal)色谱固定相.考察了单体的合成过程、分离性能以及乙腈、甲醇对溶质保留行为的影响,并采用红外光谱和元素分析对固定相进行了表征.经元素分析测得该聚合物填料的接枝链密度达0.818 mg/m2.在反相色谱模式下,该固定相可基线分离7种酚类化合物和4种胺类化合物.与C18反相柱相比,该合成柱的分离时间较短且分离效果较好.同时,流动相中有机溶剂的含量对酚类和胺类化合物的保留行为有较大的影响,随着流动相中有机溶剂含量的增加,该类化合物的保留减弱.实验结果表明,该填料具有良好的色谱性能.

3-叠氮基丙基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成工艺改进

以D-半乳糖为原料,经苯甲酰化制得1,2,3,4,6-五-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(2);2与3-氯丙醇在三氟化硼乙醚作用下进行糖苷化反应制得3-氯丙基-2,3,4,6-四-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(3);3与叠氮钠反应制得3-叠氮基丙基-2,3,4,6-四-氧-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(4);4在甲醇钠作用下脱苯甲酰基合成了3-叠氮基丙基-β-D-吡喃半乳糖苷,总收率67.8%,其结构经1H NMR和ESI-HR-MS确证。

4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成研究

目的设计合成4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的方法。方法D-半乳糖与乙酸钠反应,酯化后得到β-D-半乳糖五乙酸酯。β-D-半乳糖五乙酸酯经过溴化氢的乙酸溶液溴代得到溴代糖、再用显色团4-硝基-1-萘酚取代端基溴、最终水解除去乙酰基,再重结晶得到目标化合物。对该目标化合物进行核磁共振(^(1)H-NMR、^(13)C-NMR)和高分辨质谱(ESI-HRMS)表征确定结构。对溴代试剂选择、羟基乙酰化反应条件及重结晶条件进行优化筛选。结果表征结果显示,终产物即为化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。制备过程中溴代试剂应选择溴化氢的乙酸溶液,乙酰化反应条件应选择反应温度130℃,反应时间3 h,重结晶甲醇/水比例为3∶1。结论应用本法合成目标化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷,建立的反应条件温和,操作简便可行。

尿β-D-半乳糖苷酶活性检测方法的建立及临床意义探讨

目的以2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(CNP-GAL)为底物,建立测定尿β-D-半乳糖苷酶(GAL)活性的连续监测法,并探讨GAL在肾小管病变早期诊断中的临床意义。方法基于GAL能催化水解底物生成色原2-氯-4-硝基苯酚(CNP)的原理,对最适p H值、底物浓度、反应时间等条件进行研究,建立用于检测尿GAL的连续监测法,并用该法检测125例肾脏病变(30例继发性肾损伤、36例肾小管肾炎、25例肾癌、34例肾囊肿)患者及80名健康体检者(正常对照组)尿GAL活性。结果建立了检测尿GAL活性的连续监测法,采用柠檬酸缓冲液为最佳缓冲体系,酶促反应最适p H值为4.8,最适底物浓度为2.0 mmol/L。该法批内、批间平均变异系数(CV)分别为2.44%、4.47%,线性范围为3.2~25.6 U/L,当GAL<1.6 U/L时不能被检出。继发性肾损伤、肾小管肾炎、肾癌患者的尿GAL活性均明显高于正常对照组(P<0.05),而肾囊肿患者的尿GAL活性无明显增高。结论建立的GAL活性连续监测法敏感性高,结果准确,操作简便,可用于肾小管疾病的早期诊断。

致奶牛乳房炎链球菌新疆分离株的α-半乳糖苷酶酶活性测定及分析

以分离于新疆北部地区部分奶牛场中临床型乳房炎样品中的主要致病菌-链球菌为研究对象,采用硝基酚α-D-吡喃半乳糖苷(pNP--αGal)作为α-半乳糖苷酶反应的底物,进行酶促反应,通过405 nm的波长进行比色并测定其吸光度(OD值)。结果表明:测定α-半乳糖苷酶活性最佳pH值为5.5;所需时间为10 min;反应温度为40℃。α-半乳糖苷酶活力的测定受底物液的pH值、链球菌选择培养基、作用时间等关键因素的影响。

两种测定程序对饲用α-半乳糖苷酶活性检测结果的比较

根据α 半乳糖苷键物质及其结构组成,设计了两种饲用α 半乳糖苷酶活性的检测程序。结果表明,以棉子糖为底物的DNS法,因饲料中干扰因素较多,导致酶活性偏低。而以对硝基苯酚 α D 半乳糖吡喃糖苷底物的p NPG法,具有操作简便,灵敏度高,重现性好等特点。其测定条件为:反应系统pH4.0,反应温度40℃,反应时间10min,底物浓度5mmol/L。

黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10~4 mol-1/(L·s);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe^(3+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)和Hg^+等离子的强烈抑制,但Fe^(2+)对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。

β-半乳糖苷酶快速鉴定肠杆菌的意义

目的探讨β-半乳糖苷酶快速鉴定肠杆菌的意义。方法肠杆菌中的某些菌属具有β-半乳糖苷酶，可水解对硝基酚β-D-半乳糖苷，生成对硝基酚（PNP）游离而呈现黄色，采用酶标仪在405nm波长下比色，依据光密度值确定细菌的菌量。结果β-半乳糖苷酶（β-GAL）检测最适反应条件：pH值4．5，底物浓度2g／L，反应时间2h。最低检出限300CFU／ml。阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、大肠埃希氏菌均检测到阳性结果。而福氏志贺菌、伤寒沙门菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、克雷伯氏菌以及绿脓假单胞菌，葡萄球菌属、链球菌属和念珠菌属均检测到阴性结果。准确性和特异性均达到100％。结论该研究方法可推广到环境和水质细菌检测，实用性较强。

菊状千里光中的酚类成分

从菊科植物菊状千里光中首次分离鉴定了12种成分:丁二酸(1)、对羟基-肉桂酸(2)、对羟基苯甲酸(3)、对羟基苯甲醛(4)、4-羟基-3-乙酰基苯甲酸(5)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(6)、山奈酚(7)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(8)、芦丁(9)、槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷(10)、胡萝卜苷(11)和α-羟基-二十四烷酸(12)。所有化合物均为首次从该植物中分得。

蓝莓叶多酚单体化合物对TMAO-Fe(II)体系中TMAO热分解的影响

以氧化三甲胺-铁(Ⅱ)(trimethylamine oxide-Fe(Ⅱ),TMAO-Fe(Ⅱ))体外体系为研究对象,研究蓝莓叶多酚单体化合物对TMAO热分解的影响,并从自由基角度研究其反应机制。结果表明:蓝莓叶多酚单体化合物抑制TMAO-Fe(Ⅱ)体系中TMAO的热分解,显著降低体系中三甲胺、二甲胺和甲醛含量。质量分数越大,抑制效果越显著,槲皮素-3-D-半乳糖苷抑制效果优于绿原酸;随温度的升高,绿原酸和槲皮素-3-D-半乳糖苷对TMAO热分解有显著抑制作用。加热时间小于75 min,绿原酸和槲皮素-3-D-半乳糖苷抑制效果显著。槲皮素-3-D-半乳糖苷和绿原酸p H值分别为8.0和5.0时,抑制TMAO热分解效果最好。TMAO-Fe(Ⅱ)体系中TMAO的热分解过程中产生了自由基,绿原酸和槲皮素-3-D-半乳糖苷能够抑制自由基的产生,质量分数越高,则(CH3)3N自由基信号越弱;绿原酸和槲皮素-3-D-半乳糖苷通过抑制自由基的产生来抑制甲醛的形成。

IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓(OD600 nm)达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95μL+2.5 g/L乳糖,25℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。

中药牛蒡子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究

目的研究中药牛蒡子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法以对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为考察指标,结合植物化学的分离、纯化手段,追踪牛蒡子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并通过波谱解析对所得活性化合物进行结构鉴定。α-葡萄糖苷酶抑制活性实验在以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型上进行,筛选出α-葡萄糖苷酶抑制活性较强的化合物后,通过考察它们对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型小鼠糖耐量的影响,最终确定牛蒡子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。结果从牛蒡子中α-葡萄糖苷酶抑制活性较强的部位分离得到13个化合物,其中4个咖啡酰奎宁酸类化合物和牛蒡苷元的α-葡萄糖苷酶抑制活性较为明确。经糖尿病模型小鼠的口服糖耐量(OGTT)实验验证后,3-O-咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸和牛蒡苷元与模型组比较,均能显著提高糖耐量(P<0.05),而3-O-咖啡酰奎宁酸的作用甚至强于阳性对照药(P<0.05)。结论咖啡酰奎宁酸类化合物是牛蒡子中主要的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型的改良与比较

α-糖苷酶抑制剂可以控制餐后血糖浓度波动,从而达到预防和治疗糖尿病的作用。本文对两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型进行了改进。结果表明,以阿卡波糖作阳性对照,两种模型均适用于以脱脂乳为生长介质的产α-糖苷酶抑制剂的乳酸菌的筛选。选取12株特定乳酸菌分别用两种模型测其发酵脱脂乳上清对α-糖苷酶的抑制活性,两种模型筛选结果一致,但测得的抑制活性呈现一定的差异。当加入到脱脂乳中的阿卡波糖浓度较低时,以麦芽糖为底物的酶-抑制剂模型测得的α-糖苷酶抑制活性高于以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶-抑制剂模型。

两种乳糖酶活力测定方法比较

邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)法和双糖酶法是常用的乳糖酶活力测定方法,本文对这两种方法的线性范围、检出限、精密度、准确度和稳定性进行了比较。结果显示,ONPG法在线性范围、检出限、精密度以及稳定性方面均优于双糖酶法,但此种方法的重复性较差,需要进一步的优化。对比这两种方法,可为乳糖酶活力测定方法的合理选取提供参考。

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种金属离子的明显抑制,其中Ca2+、Cu2+、Fe3+、Hg+、Mn2+等几乎完全抑制酶活性。该酶活性在pH4.5-9.0保持稳定,在55℃时保温120min,酶活残留48%。

唐古特白刺果实酚酸类化学成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的对蒺藜科白刺属植物唐古特白刺Nitraria tangutorum果实中酚酸类成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究。方法采用硅胶柱色谱、MCI色谱及半制备高效液相色谱法等技术对其进行分离纯化,结合NMR和MS等波谱学数据鉴定单体化合物结构,对化合物的蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性进行筛选,并对活性较好的化合物进行蔗糖酶和麦芽糖酶分子对接分析。结果从唐古特白刺果实中分离得到11个化合物,分别鉴定为6’-O-对香豆酰基-α-槐糖(1)、6’-O-对香豆酰基-β-吡喃葡萄糖基-(1-2)-α-甘露糖(2)、4-羟基苯甲酸(3)、香草酸(4)、原儿茶酸甲酯(5)、对香豆酸(6)、咖啡酸(7)、6-O-对香豆酰基-D-半乳糖(8)、反式-4-O-β-D-吡喃喃葡糖基阿魏酸(9)、cynarin(10)、芍药苷(11)。化合物7对蔗糖酶和麦芽糖酶的半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC_(50))值分别为809.1和768.5μmol/L,化合物10的IC_(50)值分别为473.3和114.3μmol/L;分子对接显示化合物7对蔗糖酶和麦芽糖酶结合自由能分别为-27.6和-25.5 kJ/mol,化合物10的结合自由能分别为-36.8、-36.4 kJ/mol。结论化合物1和2是新化合物,并分别命名为香豆酰苷A和香豆酰苷B;化合物5、8~10首次从该属植物中分离得到,并且化合物7和10对蔗糖酶和麦芽糖酶都具有较好的抑制活性。

太子参化学成分研究

为了解太子参的化学成分、明确其药效物质基础,采用大孔树脂、正相和反相硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20等柱层析方法分离纯化得到10个化合物,根据理化性质和波谱数据分别鉴定为3-呋喃甲醇α-D-吡喃半乳糖苷(3-furanmethanolα-D-galactopyranoside,1)、云杉新甙(piceid,2)、二氢阿魏酸甲酯(3)、苯甲酸(4)、咖啡因(5)、胸苷(6)、水杨酸(7)、二氢阿魏酸(8)、腺苷(9)和太子参环肽B(10)。其中1为新化合物,2~7为首次从该植物中分离得到。

金背枇杷叶化学成分研究

目的：研究金背枇杷叶中的化学成分。方法：利用色谱方法分离和纯化化合物,并通过光谱方法及理化性质鉴定其结构。结果：从金背枇杷叶中分离得到6个化合物,分别鉴定为：金丝桃苷（1）、萹蓄苷（2）、棉花皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（3）、槲皮素（4）、桦木苷（5）、β-谷甾醇（6）。结论：化合物1~4、6为首次从该植物中分离得到。