土壤水解酶活性测定方法的研究进展

土壤水解酶直接参与有机物质的矿质化过程,对维持生态系统碳和养分的循环过程起重要作用。但不同研究者和实验室测定过程的差异,常给土壤酶测定方法的选定带来困难。针对这一问题,本文围绕土壤酶活性测定过程中样本贮存方式、酶底物选择以及培养条件等,对近二十多年来的研究成果进行了评述。土壤酶来源广泛,存在形式复杂,直接提取土壤酶还有很大的难度。目前土壤酶活性的测定主要是通过一定量底物在酶催化反应过程中的生成物或剩余物量来实现。基于对硝基酚衍生物为底物的分光比色法,因其成本低廉而被广泛使用。针对国际上未能建立统一的测定方法而导致研究数据之间难以进行比较的现状,作者认为现阶段土壤水解酶测定过程中应注意以下几点:1)尽量采用新鲜土样或短时间低温冷藏的土样;2)酶底物种类的选择应与国际接轨,采用饱和底物浓度使其反应速度接近最大值;3)缓冲液的pH值可与土壤pH值相近;4)4 h内培养的土壤酶,可忽略微生物抑制剂的使用。建议我国在近期内:1)应丰富土壤水解酶种类的研究;2)注重灵敏度高、需样量小以及培养时间短的荧光分析技术的应用;3)在强化典型土壤酶动力学特征研究基础上,尽快规范土壤酶活性的测定方法。

HPLC法测定大鼠UGT1A6的酶活性及体外动力学分析

目的:建立灵敏、稳定的高效液相色谱法,以对硝基酚为探针底物,评价体外大鼠肝微粒体中UGT1A6酶活性。方法:色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为20 mmol.L-1磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,V/V),流速0.8 mL.min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。对硝基酚与大鼠肝微粒体在37℃共同孵育一段时间后,加入冰乙腈终止反应,于4℃下12000 r.min-1离心15 min后,吸取上清进行HPLC分析,以双倒数作图法计算酶动力学参数。结果:对硝基酚保留时间为8.95 min,线性范围为0.5～100μmol.L-1,回归方程为Y=5973.12X+571.58(r=0.9999),最低检测限(LOD)为0.1μmol.L-1(S/N≥3),最低定量限(LLOQ)为0.5μmol.L-1,回收率为104.5%～105.5%,日内、日间RSD均小于10%,温孵体系中其他内源性物质不干扰测定;计算酶动力学参数Km为24.63μmol.L-1,Vmax为18.87 nmol.min-1.mg.protein-1。结论:该方法灵敏度高、稳定性好,适合体外对硝基酚的测定,可用于大鼠体外UGT1A6酶活性的评价及酶动力学研究。