对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

尿β-D-半乳糖苷酶活性检测方法的建立及临床意义探讨

目的以2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(CNP-GAL)为底物,建立测定尿β-D-半乳糖苷酶(GAL)活性的连续监测法,并探讨GAL在肾小管病变早期诊断中的临床意义。方法基于GAL能催化水解底物生成色原2-氯-4-硝基苯酚(CNP)的原理,对最适p H值、底物浓度、反应时间等条件进行研究,建立用于检测尿GAL的连续监测法,并用该法检测125例肾脏病变(30例继发性肾损伤、36例肾小管肾炎、25例肾癌、34例肾囊肿)患者及80名健康体检者(正常对照组)尿GAL活性。结果建立了检测尿GAL活性的连续监测法,采用柠檬酸缓冲液为最佳缓冲体系,酶促反应最适p H值为4.8,最适底物浓度为2.0 mmol/L。该法批内、批间平均变异系数(CV)分别为2.44%、4.47%,线性范围为3.2~25.6 U/L,当GAL<1.6 U/L时不能被检出。继发性肾损伤、肾小管肾炎、肾癌患者的尿GAL活性均明显高于正常对照组(P<0.05),而肾囊肿患者的尿GAL活性无明显增高。结论建立的GAL活性连续监测法敏感性高,结果准确,操作简便,可用于肾小管疾病的早期诊断。

2-氯-4-硝基苯-β-D-半乳糖麦芽二糖苷作底物测定淀粉酶总活性

目的 建立 2 氯 4 硝基苯 β D 半乳糖 麦芽二糖苷 (GalG2 CNP)作底物测定淀粉酶的方法。方法 用连续监测法对pH值 ,Km值及最适底物浓度等反应条件进行实验研究 ,并对建立的方法进行评价。结果 用双试剂连续监测法 ;试剂Ⅰ :含KSCN 2 0 0mmol/L ,CaCl2 6 .7mmol/L ,NaCl 40 0mmol/L ;试剂Ⅱ :含GalG2 CNP 2 0mmol/L ;均用pH6 .0 5 0mmol/LMES缓冲液。线性范围达 12 0 0U/L批内CV =2 .77% ,批间CV =3 .5 6 % ,与参考方法 (EPS -G7)有良好的相关性。结论 本法操作简便 ,结果准确 。

黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。

致奶牛乳房炎链球菌新疆分离株的α-半乳糖苷酶酶活性测定及分析

以分离于新疆北部地区部分奶牛场中临床型乳房炎样品中的主要致病菌-链球菌为研究对象,采用硝基酚α-D-吡喃半乳糖苷(pNP--αGal)作为α-半乳糖苷酶反应的底物,进行酶促反应,通过405 nm的波长进行比色并测定其吸光度(OD值)。结果表明:测定α-半乳糖苷酶活性最佳pH值为5.5;所需时间为10 min;反应温度为40℃。α-半乳糖苷酶活力的测定受底物液的pH值、链球菌选择培养基、作用时间等关键因素的影响。

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10~4 mol-1/(L·s);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe^(3+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)和Hg^+等离子的强烈抑制,但Fe^(2+)对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。

两种乳糖酶活力测定方法比较

邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)法和双糖酶法是常用的乳糖酶活力测定方法,本文对这两种方法的线性范围、检出限、精密度、准确度和稳定性进行了比较。结果显示,ONPG法在线性范围、检出限、精密度以及稳定性方面均优于双糖酶法,但此种方法的重复性较差,需要进一步的优化。对比这两种方法,可为乳糖酶活力测定方法的合理选取提供参考。

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种金属离子的明显抑制,其中Ca2+、Cu2+、Fe3+、Hg+、Mn2+等几乎完全抑制酶活性。该酶活性在pH4.5-9.0保持稳定,在55℃时保温120min,酶活残留48%。

基于酵母双杂交的微囊藻毒素检测系统初探

微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物,结构为环状七肽,分子量约1000Da,对生物机体具有多种毒理作用,是一类较强的肿瘤促进剂,目前没有比较简单便宜的藻毒素检测方法,本文探索建立利用酵母双杂交系统进行藻毒素检测的方法。前期实验已用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽。本文分别挑选其中亲和力较高的3个多肽,构建到酵母双杂交系统中,将不同的肽段分别融合在含有Ac-tive Domain和Binding Domain的表达载体中,共转化酵母菌株AH109,然后测定β-半乳糖苷酶活性来反映下游报告基因半乳糖苷酶的表达情况,从而通过反映培养基里面是否含有藻毒素,进而利用此方法来比较方便地检测藻毒素。

三七花中1个新的多烯炔型大环内酯

目的研究三七Panax notoginseng花的化学成分。方法采用65%乙醇水热回流提取,石油醚、醋酸乙酯与正丁醇萃取,运用大孔吸附树脂Diaion HP-20、硅胶、MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20等柱色谱及半制备液相色谱等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据进行结构鉴定,并对部分化合物进行肿瘤细胞毒和抗氧化活性评价。结果从三七花正丁醇部位分离得到11个化合物,包括大环内酯类1个、酚酸类2个、木脂素类3个、黄酮类5个,分别鉴定为(11Z,10R,17R)-17-乙烯基-10-羟基氧杂环十七烷-11-烯-13,15-二炔-2-酮(1)、反式对羟基肉桂酸(2)、3-O-对香豆酰基奎宁酸(3)、(-)-芝麻素(4)、2-甲氧基芝麻素(5)、ecbolin B(6)、槲皮素(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(9)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(10)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(11)。结论化合物1为新的多烯炔型大环内酯,命名为三七花大环内酯。化合物2~6、8为首次从人参属植物中分离得到,化合物2~9为首次从三七花中分离得到。化合物4对白血病HL-60细胞的体外肿瘤生长具有弱的抑制作用。化合物7~10表现出较强的清除DPPH自由基活性。

翅果油树叶的化学成分研究

目的对翅果油树Elaeagnus mollis叶的化学成分进行研究。方法利用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20柱色谱和制备高效液相色谱等手段进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据对化合物进行结构鉴定。结果从翅果油树叶70%乙醇提取物中分离得到16个化合物,分别鉴定为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、山柰酚-3-O-(6″-O-反式对香豆酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、山柰酚-3-O-(6″-O-顺式对香豆酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(4)、山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5)、山柰酚-3,7-O-α-L-二吡喃鼠李糖苷(6)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(7)、山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(8)、hippophamide(9)、L-色氨酸(10)、阿江榄仁酸(11)、熊果酸(12)、山柰酚(13)、芦丁(14)、腺苷(15)、β-胡萝卜苷(16)。结论化合物3~10、15均为首次从胡颓子属植物中分离得到;1、2、11、12为首次从翅果油植物中分离得到。

鸡眼草中黄酮类化学成分研究

目的研究鸡眼草中黄酮苷类化学成分。方法运用多种色谱技术分离鸡眼草中黄酮苷类成分,采用波谱技术和理化性质确定化合物的结构。结果分离得到14个化合物,分别鉴定为：槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（1）,山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（2）,芹菜素（3）,槲皮素（4）,槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（5）,木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（6）,木犀草素（7）,山柰酚-3-O-β-D槐糖苷（8）,异荭草素（9）,荭草素（10）,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（11）,7-羟基-4＇-甲氧基异黄酮（12）,苜蓿素（13）,苜蓿素-7-O-β-D-毗喃葡萄糖苷（14）。结论化合物1、2、5、6、8、9、10~14为首次从该植物中分离得到。

华重楼地上部分化学成分研究

目的研究华重楼[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara]地上部分的化学成分。方法利用HPD100大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及半制备型高效液相色谱等多种方法对华重楼地上部分体积分数75%乙醇提取物进行分离纯化,通过光谱数据鉴定化合物结构。结果从华重楼地上部分分离得到11个化合物,分别鉴定为:corchionoside C(1),β-蜕皮甾酮(2),coronatasterone(3),山柰酚3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(4),紫云英苷(5),异鼠李素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6),山柰酚3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(l→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(7),异鼠李素3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(l→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(8),山柰酚3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(9),异鼠李素3-O-β-D-吡喃半乳糖-(l→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)和异鼠李素-3-O-龙胆双糖苷(11)。结论化合物1,3~11为首次从该植物中分离得到,化合物1,3~5和8~10为首次从该属植物中分离得到。

地桃花中黄酮苷类成分研究

目的研究地桃花(Urena lobata L.)中的黄酮苷类成分。方法利用大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20等多种柱色谱结合半制备液相色谱进行分离纯化,根据化合物理化性质及MS、NMR等光谱数据进行结构鉴定。结果从地桃花乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离得到10个黄酮苷类化合物:槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(1)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(2)、槲皮素-3-O-β-D-呋喃芹糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(3)、山柰酚-4'-O-β-D-呋喃芹糖-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(4)、山柰酚-3-O-β-D-呋喃芹糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)、山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)。结论化合物1~3,6~10为首次从地桃花中分离得到。