对虾白斑综合症病毒类锌指蛋白基因(wsv063、wsv069和wsv477)的表达和纯化

从对虾白斑综合症病毒基因组的预测开放阅读框中选取3个编码类锌指蛋白的基因wsv063、wsv069和wsv477,将它们克隆到pET-GST表达载体,以E.coliBL21(DE3)为宿主菌,成功表达了GST融合的目的蛋白.表达的GST-WSV063和GST-WSV477在菌体里主要以包涵体形式存在,GST-WSV069在菌体里可溶性形式和包涵体形式几乎等量存在.采用glutathione sepharose 4B或Ni-NTA agarose亲和层析对目的蛋白进行了纯化.以上3种病毒蛋白的表达和纯化为进一步研究它们的功能奠定了基础.

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白WSV308的鉴定

结合SDS-PAGE电泳和质谱分析,发现了一分子量为51kDa的蛋白,它是对虾白斑综合症病毒基因ORFwsv308的表达产物.将wsv308克隆到pET-His表达载体,以E.coliBL21为宿主菌,成功表达并纯化目的蛋白后制备抗体.Western blot实验中蛋白特异抗体只与完整的病毒和核衣壳裂解蛋白中的WSV308反应,而不和膜蛋白反应,证明wsv308所编码的蛋白在完整病毒颗粒上定位于核衣壳.免疫电镜定位中金颗粒只特异地标记在核衣壳表面上,不存在于完整病毒表面上.

白斑综合症病毒对斑节对虾亲虾的感染及垂直传播的初步研究

白斑综合症病毒 (WSSV)对斑节对虾 (Penaeusmonodon)亲虾的致病力强 ,其致病性特征与对未成熟个体的致病性特征相同 ;经WSSV感染的斑节对虾亲虾的死亡率为 10 0 % .感染了WSSV的亲虾的PCR检测结果均呈阳性 ,组织切片观察可见到明显的组织病变 ,电镜观察发现病变组织 (包括卵巢 )的细胞内有大量病毒粒子 ;原位杂交结果证明 ,患白斑综合症的斑节对虾亲虾的卵巢中不仅卵母细胞感染上病毒 ,卵细胞也感染上了病毒 .这些结果表明 ,WSSV在斑节对虾中具备垂直传播的条件 .

中国明对虾抗白斑综合症病毒分子标记的筛选

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对经过连续4代选育的抗白斑综合症病毒(WSSV)中国明对虾(Fennerope naeuschinensis)(XY4)及未经选育的与XY4来源相同的中国明对虾野生群体(HB)进行分析,以期筛选出与抗病性状相关的分子遗传标记,为进一步的基因定位以及中国对虾的种质资源保护和分子标记辅助育种提供有力的技术支撑和理论依据。共进行220个RAPD单引物和114对双引物的检测,产生标记数目共计2439个。依据标记在群体中出现的频率和变化规律,共筛选出5个可能与抗病相关的特异性标记,对这些特异性标记进行测序并将测序结果进行BLAST分析,发现测得片段的序列与数据库中序列的相似性较低,未能找到与所测序列同源性较高的功能基因。这与利用AFLP技术分析的结果一致。由于选育过程施加人工选择,推论这些特异性标记虽不是抗WSSV分子标记,但可能与抗病性状密切相关。

感染白斑综合症病毒(WSSV)对虾相关免疫因子的研究

12 9尾中国对虾 (Penaeuschinensis)分别捕自未暴发白斑综合症 (WSSV病毒所致 )虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒 (WSSV)程度。用 96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力 (Ua)、溶菌活力 (UL)、酚氧化酶 (PO)活性以及过氧化酶 (POD)相对活性 ;用硝酸纤维膜斑点法测定其碱性磷酸酶 (ALP)相对活性 ;用血凝法测定其凝集效价(HAT)。通过对以上免疫指标进行统计分析 ,结果表明 ,WSSV感染与对虾血淋巴PO活性以及ALP相对活性变化有紧密联系 ;不同虾池各免疫因子差异显著 ,发病虾池虾样各免疫指标平均值均低于其他虾池 ;曾发病虾池的虾样PO活性较强 ;WSSV与HPV感染无统计学意义上的相关性 ;未发病虾池与曾发病虾池实验对虾的Ua与UL 相关性极显著 ,发病虾池实验对虾Ua与UL 呈负相关 ;发病虾池对虾PO与ALP活性相关性显著。

斑节对虾白斑综合症病毒部分基因组文库及核酸探针检测法

通过分离纯化白斑综合症病毒 (WSSV)粒子 ,抽提病毒DNA ,用限制性内切酶EcoRⅠ或SalⅠ酶切后 ,克隆入质粒pBluescriptⅡKS中 ,从而建立了WSSV部分基因组文库。估计WSSV基因组DNA在16 5kb以上。将WSSVEcoRⅠ克隆片段标记制备为探针 ,进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交 ,其结果证明了克隆片段对WSSV特异 ,并为检测WSSV提供了方法。通过对部分基因组文库序列分析发现 ,WSSV核酸序列与已知杆状病毒核酸序列的同源性低 ,与GenBank中已有病毒核酸序列比较都无较大同源性 ,说明WSSV不属于杆状病毒科 ,目前只能列为未分类的无脊椎动物病毒 ,其分类地位尚需更多证据方能确定。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化

诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)在生物机体免疫 ,特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注 ,由其催化产生的一氧化氮 (NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外 ,还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氮唑蓝 (NBT)法和血细胞形态观察等方法 ,对中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上 ,通过亚硝酸盐法和L 瓜氨酸法对比 ,研究了感染白斑综合症病毒 (WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氮合成酶的变化情况。结果显示 ,中国明对虾在感染WSSV后 ,iNOS活性在 1 2h内有上升趋势 ,实验 36h后酶活性显著下降 ,至 60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时 ,被脂多糖 (LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是 ,核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示 :实验 36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS ,但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏 ,使得iNOS活性显著降低 ,对虾也趋于死亡。因此 。

赤潮异弯藻对中国对虾感染白斑综合症病毒的影响

1 引言 白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是近年来危害我国乃至世界对虾养殖业的主要流行病原[1-4].WSSV病毒暴发流行范围广、致病性强,自出现以来给对虾养殖业造成了巨大的损失.对虾病毒病的发生是对虾自身的健康状况、病原生物。

用DNA斑点杂交法检测对虾及其饵料和环境生物携带白斑综合症病毒状况的调查

于 1996～ 1998年采用DNA斑点杂交法 ,完成了共计 836份养殖对虾 ,2 13份对虾饵料和环境生物样品的检测。结果显示 ,对虾在每年的 4～ 10月都可检测出白斑综合症病毒 (WSSV) ,6月出现最高峰 ,阳性检出率达到 4 2 .6 % ;其次 ,为 7月和 5月 ,分别达 31.6 %和 2 4 .5 %。在对虾不同生长阶段 (包括亲虾、各期幼体、仔虾、幼虾及成虾 )均可检出WSSV ,其中以仔虾的带毒率最高 ,达 36 .4 % ,其次为糠虾幼体 ,达 34.6 %。体长范围 1.1～ 2 .0cm的仔虾阳性率最高 ,其次体长为 5 .1～ 6 .0cm的幼虾样品。检测的中国对虾样品(6 2 5份 )带毒率为 16 .8% ,日本对虾样品 (2 11份 )带毒率为 4 5 .0 %。对虾主要饵料及环境生物类群包括鱼类、虾类、蟹类、桡足类、端足类、沙蚕、卤虫均可检出WSSV ,其中小型虾类、端足类、桡足类、蟹类样品的WSSV检出率均高于 2 0 %。

白斑综合症病毒对斑节对虾幼体和仔虾的致病性

斑节对虾 (Penaeusmonodon)的蚤状幼体和糠虾幼体经人工感染WSSV后 ,部分幼体的发育变态受到影响 ,其死亡率略高于对照组 ,但PCR二步法检测的结果为WSSV阴性 .仔虾经人工感染WSSV后 ,部分个体的游动方式异常 ,感染 6 0h后的死亡率达 10 0 % ,样品经PCR二步法检测呈WSSV阳性 .

盐度变化对日本对虾暴发白斑综合症病毒病的影响

为研究盐度在对虾暴发白斑综合症 (whitespotsyndrome)过程中所起的作用 ,进行了盐度变化对日本对虾免疫水平的影响实验及不同盐度下的人工感染实验。结果显示 :(1)盐度是影响日本对虾生理、存活的重要环境因子 ;(2 )盐度变化能够影响对虾的免疫状况 ,盐度升高和降低都会降低日本对虾的免疫水平 ;(3)在偏离对虾正常生存盐度的环境中 ,对虾抵御外来感染能力降低 ,易受病原体如WSSV的感染 ;(4)盐度变化是导致对虾爆发白斑综合症的重要诱因之一。

抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)中草药的筛选及番石榴叶水提取物对WSSV致病性的影响

通过人工感染试验,比较了11种中草药水提取物对对虾白斑综合症病毒(WSSV)致病性的影响,在此基础上,研究了番石榴叶水提取物的浓度和处理时间对WSSV的消毒效果。结果表明,在11种中草药提取液中,仅有番石榴叶水提取物对WSSV有显著的杀灭作用,处理时间超过12 h可使WSSV失活,消毒效果与药物和病毒的相对浓度相关。

高位池养殖对虾携带白斑综合症病毒变化

采用实时荧光定量PCR技术研究6口高位池塘斑节对虾和凡纳滨对虾携带WSSV变化,结果表明:养殖过程中凡纳滨对虾WSSV携带量最高为9.7×105拷贝/g;斑节对虾最高携带量为9.5×105拷贝/g。凡纳滨对虾WSSV感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为80.0%;60d为90.0%;90d为90.0%;120d为93.3%,斑节对虾潜伏感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为73.3%;60d为83.3%;90d为90.0%;120d为96.7%。

对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP28的原核表达和性质研究

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus ,WSSV)的一个重要的囊膜蛋白。为了便于研究VP2 8在和宿主细胞相互作用过程中扮演的角色 ,将VP2 8基因克隆到一个原核表达系统 ,对原核表达的VP2 8的特性进行了研究 ,并制备了抗VP2 8的多克隆抗体和单链抗体 ,对原核表达的和天然病毒的VP2 8蛋白免疫原性进行了比较。结果表示 ,原核表达的VP2 8与天然蛋白具有相似的免疫原性。

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。

白斑综合症病毒(WSSV)在对虾养殖过程中传播途径的调查

为探讨人工养殖条件下池塘中对虾是如何感染暴发性流行病 ,作者通过对人工养殖对虾暴发白斑综合症的池塘进行生物调查和取样 ,经 PCR检测 ,获得了一些有意义的结果。发现 :在暴发白斑病的池塘中 ,中国对虾和日本对虾以及池中的脊尾白虾均可检测到阳性 ,阳性率大小与发病的程度有关 ;蟹类未检测到阳性个体 ;鱼类和底栖的沙蚕亦未检测到阳性 ;浮游动物的糠虾类未检测到阳性 ;桡足类检测为阳性 ,说明桡足类是对虾白斑病毒中间宿主之一 。

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系。构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×10~7～1.5×10~1个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝。标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R^2=0.9967。该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应。运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性,而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性。实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义。

盐度变化对携带白斑综合症病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的影响

研究盐度渐变和突变对WSSV在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内增殖的影响。结果表明,盐度由起始盐度(23±1)往高盐度(32±1)和低盐度(14±1)突变在整个实验中对凡纳滨对虾的累积死亡率和对虾体内病毒增殖的影响显著(P<0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度累积死亡率分别为(61.1±10.7)%、(48.9±1.9)%、(63.3±12.0)%,病毒含量分别为6.0×107、3.7×106、5.3×107 copy/g;后感染WSSV实验,分别为(75.6±3.8)%、(52.2±13.4)%、(63.3±3.3)%;病毒含量分别为5.7×107、2.3×106、2.8×107 copy/g。盐度渐变实验各组至24h对虾死亡率低于18.9%,48h出现死亡高峰,72—96h存在显著差异(P<0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度最大死亡率分别为(75.6±5.1)%、(38.9±5.1)%、(69.3±6.9)%,病毒含量分别为7.6×107、5.3×106、2.4×106copy/g;后感染WSSV实验分别为(46.7±10)%、(45.6±18.9)%、(74.4±13.9)%;病毒含量分别为5.1×106、4.8×105、1.0×107 copy/g。因此盐度变化会影响对虾的抗病能力,可造成对虾体内WSSV快速增殖;对携带WSSV对虾,盐度变化会大大提高WSSV从潜伏感染转为急性感染的可能,盐度是引起WSSV从潜伏感染转为急性感染的关键影响因子之一。

虾池中桡足类及其休眠卵携带对虾白斑综合症病毒的初步调查研究

探讨对虾白斑综合症（White Spot Syndrome WSS）与虾池中桡足类之间的关系，于2003年5～10月份，在暴发过对虾白斑综合症的池塘中采集桡足类样品共128个，并从冬季底泥样品分离出桡足类休眠卵样品20个，以及此种休眠卵孵化得来的桡足类幼体样品5个。利用PCR斑点杂交法以及巢式PCR法检测样品中对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus WSSV）携带情况。结果表明，5～10月份桡足类样品中均能检测到阳性样品，总的阳性率为56．3％；其中，5月份样品阳性率为37．5％，6，8，9，10月份各取样1次，每次样品中的阳性率均在60％以上。在20例桡足类休眠卵样品中有1例为阳性，阳性率为5％；并且实验室中孵化此种休眠卵得来的桡足类幼体样品中检测到阳性，阳性率为40％。本研究初步表明，桡足类是WSSV的携带者或传播媒介之一，且冬季池塘底泥中携带WSSV的桡足类休眠卵可萌发出带病毒的桡足类。

白斑综合症病毒在日本囊对虾精养池塘中的动态变化

用实时荧光定量PCR技术检测了高密度精养池塘中日本囊对虾体内及浮游动物白斑综合症病毒携带量的动态变化,检测结果显示,两口池塘的日本囊对虾苗种均携带白斑综合症病毒,达2.43×10~5~9.42×10~5 IU/mg;浮游动物也携带微量白斑综合症病毒,达6.78×10~2~8.02×10~2 IU/mg。在整个养殖过程中,日本囊对虾多个组织均携带白斑综合症病毒,平均病毒量为鳃>肌肉>肝胰腺>胃;各组织病毒携带量的变化趋势不一致,肌肉、肝胰腺、胃等呈现明显的先降后升趋势,最低降至1.78×10~3 IU/mg,鳃白斑综合症病毒携带量的下降幅度较小,最低为7.29×10~4 IU/mg。浮游动物的病毒量在白斑综合症爆发前波动不明显,发病时急剧升高。综合认为,苗种携带是白斑综合症病毒的主要来源;当养殖进入中后期,底质变差、水温降至病毒适宜复制的温度时,易爆发白斑综合症。