对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。

常用酰基辅酶A的合成

酰基辅酶A作为重要的酰基活化形式在代谢中起着重要作用,而获得酰基辅酶A是进行相关代谢过程研究的基础。目前酰基辅酶A的合成方法主要为化学合成和酶法合成两类,不同结构的酰基辅酶A适用的合成方法有所不同。本文采用化学合成(酸酐合成、咪唑基活化和PyBOP一步合成)和酶法合成(辅酶A连接酶和酰基转移酶完成体外催化),合成了苯乳酰辅酶A、异戊酰辅酶A、苯甲酰辅酶A、对香豆酰辅酶A和肉桂酰辅酶A,并对合成结果进行了评价。结果表明,酶法具有转化率高,专一性强的优势,化学合成具有高效快速合成的特点。本文为将来合理选择酰基辅酶的合成方法提供了参考。

四种植物中对香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的活性定量分析与酶调控组分的含量关系研究(英文)

目的:通过测定4CL合成产物对香豆酰辅酶A的产量,定量研究从麦芽、丝瓜、土豆、大豆中提取的4CL活性并与4种植物中总黄酮和总木质素的含量进行相关性分析。方法:应用平行合成仪获得最佳合成条件,采用紫外可见分光光度法测定植物中总黄酮、总木质素与总蛋白含量,运用高效液相色谱紫外与蒸发光散射检测器和高效液相与质谱联用技术对4CL催化合成产物对香豆酰辅酶A进行定性定量分析。结果:4种植物中4CL的比活顺序依次为:麦芽、丝瓜、土豆、大豆,对应的对香豆酰辅酶A的产量依次为0.552,0.729,0.946和14.456mg·g-1新鲜植物。研究结果表明在这4种植物中4CL活性与总黄酮含量呈正相关关系而与总木质素含量呈一定的负相关关系。结论:本文建立了一种快速定量并精确比较4种植物中4CL活性的方法,同时阐明了植物中总木质素和总黄酮含量与4CL活性的相关性。

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。