寻常性天疱疮抗原EC1-2和EC3-4表位的分子克隆与蛋白表达

目的：克隆并表达寻常性天疱疮抗原（PVA，即桥粒芯糖蛋白-3）的EC1-2和EC3-4表位，用于通过血清学方法特异性诊断天疱疮和了解PVA的表位与抗PVA抗体间的联系。方法：从角朊细胞抽提RNA，逆转录合成cDNA,扩增目的基因EC1-2和EC3-4后与质粒载体PGEX－4T-1连接，电转导入大肠杆菌BI21，经IPTG诱导后表达EC1-2和EC3-4融合蛋白，SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜，免疫印迹法检测抗PVA抗体。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定，克隆的EC1－2、EC3-4基因与PC／CGENE登录的序列一致；表达的重组蛋白仅与寻常性天疱疮血清反应，不与大疱性类天疱疮、系统性红斑狼疮以及正常人血清反应。结论：该重组蛋白具有高度抗原特异性，此项研究为通过血清学方法诊断寻常性天疱疮和鉴别诊断其它大疱性皮肤病提供了方法，为进一步研究粘附分子与天疱疮发病的时间关系奠定了基础。

鼠抗寻常性天疱疮抗原噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :应用重组噬菌体抗体库技术制备抗寻常性天疱疮抗原 (PVA)的单链抗体。方法 :用PVA免疫小鼠 6w后 ,抽取小鼠脾脏细胞RNA ,逆转录为cDNA。设计针对小鼠抗体重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)的特异性引物 ,PCR扩增出VH 和VL 片段。用带有VH3′端、连接肽和VL5′端序列的引物修饰VL 得VL′后 ,与VH 进行重叠延伸拼接 (splicingbyoverlapex tension ,SOE) ,连接成VH—Linker—VL(ScFv) ,并大量扩增。此ScFv经限制性内切酶Sfi1和Not1酶切后 ,以噬粒pCANTAB 5E为载体 ,构建重组质粒 ,转导TG1 感受态菌 ,建成库容为 1 5× 10 6 的噬菌体抗体库 ,用PVA筛库。结果 :构建了抗PVA的特异性单链抗体库 ,筛选出一高丰度表达单链抗PVA抗体的细胞株。结论 :从小鼠噬菌体抗体库中获得特异性的、单克隆的。