线粒体钙单向转运体相关钙超载调控钙调蛋白对雨蛙肽诱导胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响

目的 通过体外细胞研究探讨线粒体钙单向转运体(MCU)相关钙超载通过调控钙调蛋白(CaM)对雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响。方法 使用10^(-7)mol/L雨蛙肽及10^(-5)mol/L MCU抑制剂钌红(RR)干预人胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)24 h,将细胞分为:Control组、雨蛙肽组、RR组、雨蛙肽+RR组。Western blot法检测细胞内MCU及CaM蛋白表达,荧光探针法检测细胞内游离Ca^(2+),免疫荧光双标法检测细胞内线粒体Ca^(2+),微丝染色法观察细胞微丝骨架结构。结果 雨蛙肽组与Control组比较,MCU及CaM蛋白表达、细胞质及线粒体内Ca^(2+)含量升高(P<0.05),细胞微丝骨架破坏;雨蛙肽+RR组与雨蛙肽组比较,MCU及CaM蛋白表达、胞质Ca^(2+)及线粒体内Ca^(2+)含量降低(P<0.05),细胞微丝骨架破坏减轻。结论 MCU相关钙超载可能通过激活CaM促进雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的破坏。

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法。方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代。在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色。结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞。结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长。

感染人巨细胞病毒后涎腺导管上皮细胞的病理形态学改变

目的:探讨涎腺导管上皮细胞感染人巨细胞病毒(HCMV)后的病理形态学改变。方法:应用免疫组化法标记11例腮腺巨细胞包涵体病尸检蜡块中HCMV感染细胞;应用HE染色、倒置相差显微镜和透射电镜从体内外观察HCMV感染细胞的形态学改变。结果:组织内HCMV感染细胞从未感染时的柱状变为圆形或椭圆形,体积增大,出现包涵体,近管腔处胞浆内见少量颗粒状物。体外培养的涎腺导管上皮细胞感染HCMV后,先是胞体皱缩变为球形,核略增大,以后细胞逐渐从培养瓶底部脱落。与体内感染相比,体外HCMV感染可导致宿主细胞在大小、形状、与周围细胞的连接和包涵体等方面出现差别。结论:体内外HCMV感染涎腺导管上皮细胞导致的形态学改变不同。

角质细胞生长因子促进大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖

目的探讨不同浓度的角质细胞生长因子(KGF)对大鼠胰腺导管上皮细胞增殖的影响,寻求最佳浓度。方法免疫细胞化学染色及RT-PCR方法鉴定SD大鼠胰腺导管上皮细胞;不同浓度的KGF刺激胰腺导管上皮细胞增殖,寻求最佳浓度。结果大鼠胰腺导管上皮细胞表达Nestin和CK19,不表达Insulin及Glucagon;不同浓度KGF刺激胰腺导管上皮细胞2 d后,细胞均有不同程度增殖,20μg/L KGF作用2 d时,细胞数为0.35±0.03,显著高于对照组的0.27±0.02(P<0.01)。结论 KGF在本实验的剂量范围内可促进胰腺导管上皮细胞增殖,20μg/L为促进增殖的最佳浓度。

HCMV对涎腺导管上皮细胞组织蛋白酶D表达的影响

目的研究HCMV对涎腺导管上皮细胞组织蛋白酶D表达的影响。方法用免疫组化方法研究腮腺巨细胞包涵体病(PCID)石蜡包埋组织中组织蛋白酶D的表达;用Westernblot法研究HCMV感染对体外培养的涎腺导管上皮细胞组织蛋白酶D表达的影响;用半定量RT-PCR法研究HCMV对体外培养的涎腺导管上皮细胞组织蛋白酶D转录水平的影响。结果 PCID组织包涵体巨细胞组织蛋白酶D表达呈阳性。HCMV感染体外培养的涎腺导管上皮细胞0～96h,组织蛋白酶D前体和有活性的重链组织蛋白酶D缓慢上调但一直保持在正常水平以下;有活性的单链组织蛋白酶D很快上调,而且在96h达到正常水平的1.91倍;导管上皮细胞组织蛋白酶D的mRNA水平和蛋白水平呈反向平行关系。结论 HCMV可诱导涎腺导管上皮细胞活性单链形式组织蛋白酶D的表达上调。

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化

目的探讨上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺(NIC)、肝细胞生长因子(HGF)、葡萄糖(Glu)、角脘蛋白生长因子(KGF)和β细胞素在大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化的作用。方法采用健康SD大鼠胰腺导管上皮细胞,分于70个培养孔中,加入含有多种营养因子(不含血清)的PRMI1640培养液中培养。每个孔中6种诱导剂均进行随机组合。在胰岛样细胞团(ICCs)形成前后的不同天数进行细胞计数、电镜观察、胰岛素测定以及免疫细胞化学和荧光分析。结果胰腺导管上皮细胞培养7d后,单个贴壁上皮细胞分裂增殖,呈鹅卵石样细胞片,单层覆盖;加入诱导和促生长因子后,单层覆盖上皮细胞中逐渐产生一定数量类似胰岛样球状细胞团,直径为80～130μm。结论6种促生长和诱导因子中,Glu、NIC、KGF、EGF作用较强;在所设定的浓度范围内,其作用均随着浓度的增加而增强。

人GLP-1(7-36)酰胺促进非肥胖型糖尿病小鼠胰腺导管上皮细胞分化

目的探讨人胰高糖素样肽1(GLP-1)对非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰腺导管上皮细胞分化与增殖的影响。方法 GLP-1治疗组小鼠用微型渗透泵皮下持续泵入人GLP-1,对照组小鼠泵入生理盐水,4周后将其胰腺组织分别做导管细胞角蛋白(DCK)/胰岛素双重免疫荧光染色、胰腺十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)/胰岛素双重免疫荧光染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)/DCK双重免疫染色,显微镜下观察胰腺导管上皮细胞的分化和增殖。结果在GLP-1治疗组胰腺导管上皮中可见较多胰岛素阳性细胞及PDX-1/胰岛素双阳性细胞,而在对照组几乎看不到;GLP-1治疗组小鼠BrdU阳性的导管上皮细胞的百分数与对照组小鼠相比明显增高(P<0.001)。结论人GLP-1持续刺激NOD小鼠后,可促进胰腺导管上皮细胞分化与增殖。

人巨细胞病毒感染对人涎腺导管上皮细胞存活的影响

目的:研究体内外人巨细胞病毒(HCMV)感染对人涎腺导管上皮细胞存活的影响。方法:用细胞凋亡检测技术研究11例腮腺巨细胞包涵体病(PCID)尸检石蜡包埋组织中细胞凋亡情况;用免疫组化法检测PCID组织存活素、PCNA和P53的表达;用流式细胞术检测HCMV感染对体外培养的涎腺导管上皮细胞周期的影响。结果:所有包涵体巨细胞凋亡检测呈阴性。包涵体巨细胞存活素和P53表达呈阴性,其他导管上皮细胞呈弱阳性(±～+);75%的包涵体巨细胞核PCNA表达呈弱阳性(±)。与模仿感染组相比,病毒感染组G0/G1期细胞所占百分数在感染36、60和72 h显著增高(P均<0.01)。结论:HCMV感染后涎腺导管上皮细胞并未发生凋亡,而发生了增殖阻滞,大部分细胞处于G1期。

角脘蛋白生长因子与胰腺导管上皮细胞的体外增殖

背景:胰腺导管上皮细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞,但胰腺导管上皮细胞体外增殖潜能较差,限制了胰岛细胞移植治疗糖尿病的发展。目的:探讨不同质量浓度角脘蛋白生长因子对SD大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖活力的影响,并寻找最佳浓度,从而得到大量增殖的胰腺导管上皮细胞。方法:运用胶原酶逆行灌注法分离大鼠胰腺导管上皮细胞,密度梯度离心法纯化细胞,而后体外扩增,分别通过免疫细胞化学染色及RT-PCR进行鉴定。在培养基中加入不同质量浓度的角脘蛋白生长因子刺激胰腺导管上皮细胞增殖,通过细胞计数及MTT法测定细胞增殖能力。结果与结论:胰腺导管上皮细胞表达CK19蛋白;不同浓度的角脘蛋白生长因子培养基中胰腺导管上皮细胞形态正常,5μg/L角脘蛋白生长因子组比其他浓度组细胞数量少(P<0.01),而10,15与20μg/L角脘蛋白生长因子组的细胞数量相近(P>0.05)。提示不同浓度的角脘蛋白生长因子均可促进大鼠胰腺导管上皮细胞的增殖,10μg/L角脘蛋白生长因子可能是促进大鼠胰腺导管上皮细胞增殖的最佳培养剂量。

体外人巨细胞病毒感染对人涎腺导管上皮细胞角蛋白表达的影响

目的探讨体外人巨细胞病毒(HCMV)感染对人涎腺导管上皮细胞(HSG)角蛋白表达的影响。方法应用免疫细胞化学法检测体外培养的HSG中角蛋白8和18(K8和K18)的表达;蛋白印迹法检测HCMV感染对体外培养的HSG中K8和K18表达的影响;半定量逆转录聚合酶链式反应法检测HCMV对体外培养的HSG中K8和K18转录水平的影响。结果体外培养的HSG中K8和K18呈阳性表达;HCMV感染体外培养的HSG 0～96 h,K8的表达呈逐渐下降趋势,K18的表达在感染后24h内表达升高,此后下降;K8和K18的mRNA水平和蛋白水平均呈反向平行关系。结论 HCMV感染体外培养的HSG可引起角蛋白表型发生改变,K8和K18表达水平改变的调节发生在转录后水平。

体外胰腺导管上皮细胞与胰腺腺体培养对比分析

目的:比较以胰腺导管上皮和腺细胞培养获取胰岛细胞的差别,以探寻获取胰岛细胞的可靠途径。方法:用胶原酶消化法,获取胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞,进行体外培养,观察其细胞形态、细胞纯度和胰岛素分泌量,比较两种细胞来源获取胰岛细胞的差异性。结果:在光镜下见胰腺导管上皮细胞组(Ⅱ组)具有较强的增殖能力,能够产生胰岛样细胞团;硫腙(DTZ)染色阳性细胞团纯度记数高于腺体细胞组(Ⅰ组) (87.6 % 73.7% ) ;胰岛素分泌量明显高于后者(2 37.2 3±5 2 .4 1 5 6 6 .0 7±5 5 .6 6 ;16 2 .87±38.17 4 31.2 2±5 7.5 9;10 5 .89±31.4 7 35 9.6 8±6 2 .2 7;P <0 .0 1) ,但组内则无统计学意义的差别(P >0 .0 5 ) ,Ⅰ、Ⅱ组胰岛素分泌量随时间延长而衰减,其第4、6天分泌量分别为第2天的6 8%、4 4 %和75 %、6 3%。结论:胰腺导管上皮细胞具有较强的转分化为胰岛细胞的能力,在胰岛细胞培养取材过程中,不能忽视或丢弃,它可能是可转分化为胰岛细胞的胰腺干细胞之一。

氧化应激对人胰腺导管上皮细胞增殖的影响

目的探讨氧化应激对人胰腺导管上皮细胞增殖的影响。方法不同浓度过氧化氢(H2O2)作用于人胰腺导管上皮细胞6～48 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞光密度(OD),绘制细胞生长曲线,计算细胞存活率;采用碘化丙啶(PI)单染色法检测细胞周期,计算细胞增殖指数(proliferation index,PI’)。结果细胞处理6 h,H2O2300μmol/L组存活率下降[(79.10±9.21)%vs.(100.00±14.84)%,P<0.05]。12 h H2O2300μmol/L组OD值降低(0.277±0.022 vs.0.309±0.015;P<0.05),存活率明显下降[(56.90±29.91)%vs.(100.00±20.91)%,P<0.01]。24h H2O2100、200、300μmol/L组OD值明显降低(0.493±0.011,0.434±0.029,0.373±0.014 vs.0.529±0.011;P<0.01),存活率明显下降[(87.95±3.73)%,(67.61±9.87)%,(46.84±4.76)%vs.(100.00±3.85)%;P<0.01],PI’明显降低[(25.50±1.81)%,(25.20±1.80)%,(21.11±1.78)%vs.(32.20±2.33)%;P<0.01]。48 h H2O225μmol/L组OD值明显升高(0.683±0.014 vs.0.587±0.024,P<0.01),存活率明显升高[(127.39±3.99)%vs.(100.00±6.72)%;P<0.01],H2O225、50μmol/L组PI’明显升高[(44.20±4.75)%,(40.50±2.67)%vs.(35.40±1.25)%;P<0.01];而H2O2100、200、300μmol/L组OD值明显降低(0.533±0.011,0.440±0.018,0.376±0.003 vs.0.587±0.024;P<0.01),存活率明显下降[(84.74±3.08)%,(58.20±5.10)%,(39.87±0.71)%vs.(100.00±6.72)%;P<0.01],PI’明显降低[(24.30±1.83)%,(21.97±1.82)%,(16.94±3.55)%vs.(35.40±1.25)%;P<0.01]。结论低浓度H2O2显著促进人胰腺导管上皮细胞增殖,呈时效及量效关系;反之,高浓度H2O2抑制细胞增殖。

Bmi-1基因诱导人胰腺导管上皮细胞恶性转化

目的探讨原癌基因B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi-1)过表达对人正常胰腺上皮细胞株h TERT-HPNE恶性转化的影响。方法采用逆转录病毒介导转染方法将携带原癌基因Bmi-1的质粒或空质粒稳定转染h TERT-HPNE,通过Real-time PCR及Western blot在m RNA及蛋白水平鉴定转染效果。采用MTS法、Traswell小室法、软琼脂克隆形成试验检测稳定转染Bmi-1对h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力的影响。结果 Real-time PCR及Western blot结果均表明成功建立稳定转染Bmi-1基因的h TERT-HPNE细胞株。过表达Bmi-1基因使h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力明显增高。结论在细胞水平过表达Bmi-1基因恶性转化h TERT-HPNE细胞。

SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究

目的分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞,为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法用酶消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞,观察细胞增殖动态,用CK-19进行免疫组化鉴定。结果胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增,有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论低血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。

大鼠胰腺导管上皮细胞及转分化胰岛样细胞免疫学特性研究

目的:通过对大鼠胰腺导管上皮细胞、转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞进行免疫原性比较,了解胰腺导管上皮细胞及转分化胰岛样细胞的免疫学特性。方法:大鼠胰腺导管上皮细胞,转分化胰岛样细胞和天然胰岛在体外与淋巴细胞共培养,检测淋巴细胞MHCⅠ、MHCⅡ抗原决定簇,IFN-γ和IL-2、IL-4水平。将三组细胞分别植入到大鼠糖尿病模型皮下,流式细胞技术检测外周血MHCⅠ、MHCⅡ表达、ELISA检测IL-2、IL-4水平和机体对其反应的病理学变化。结果:三组细胞与淋巴细胞共培养,MHCⅠ的表达未见明显差异(P<0.05),MHCⅡ的表达胰岛样细胞(29.5%±3.1%)和天然胰岛细胞(32.6%±3.6%)较胰腺导管上皮细胞(10.8%±0.9%)明显升高(P<0.05)。淋巴细胞分泌IL-2水平和Elispot检测分泌IFN-γ的细胞数,胰腺导管上皮细胞较胰岛样细胞和天然胰岛细胞组显著性降低(P<0.01)。植入糖尿病大鼠模型的外周血IL-2水平和淋巴细胞MHCⅡ表达均随着植入时间逐渐升高,胰岛样细胞和天然胰岛细胞组较胰腺导管上皮细胞组升高明显,IL-4水平在三组细胞无明显差异。病理结果显示胰腺导管上皮细胞组淋巴细胞浸润较胰岛样细胞和天然胰岛细胞组为轻。结论:胰腺导管上皮细胞具有低免疫原性,转分化的胰岛样细胞免疫原性近似天然胰岛。

肝间质细胞与肝导管上皮细胞间的接触数量可能控制肝脏再生

据Cordero-Espinoza L 2021年7月28日[Cell Stem Cell,2021 Jul 28. Doi:10.1016/j.stem.2021.07.002.]报道,德国马克斯-普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所(MPI-CBG)、英国剑桥大学格登研究所和剑桥大学生物化学系的研究人员合作发现,间质细胞(mesenchymal cell)可以激活或停止肝脏再生。间质细胞通过它们与再生性细胞(肝导管上皮细胞)建立的接触数量来实现这一目的。研究表明,这种再生过程中可能引起癌症或慢性肝病,是由两种细胞群体之间错误的接触造成的。

涎腺导管上皮细胞体外感染HCMV模型的建立

目的 建立涎腺导管上皮细胞体外人巨细胞病毒 (HCMV)感染模型。方法 用免疫细胞化学方法初步鉴定涎腺导管上皮细胞 (HSG)角蛋白 8(cytokeratin 8,CK8)和角蛋白 18(CK18)抗原的表达 ;观察HCMV感染HSG后导致的病变 ;观察宿主细胞中病毒颗粒的超微结构 ;用RT PCR及nest RT PCR检测HCMVIE1(即刻早期 1) /IE2基因的转录 ;用免疫细胞化学法检测HCMV感染细胞中IE1/IE2蛋白的表达。结果 呈上皮样贴壁生长的HSGCK8和CK18阳性表达 ;HCMV感染后 12小时 ( 12h .p .i.)即可见细胞病变 ,6 0h .p .i.CPE已极为明显 ,72h .p .i.绝大部分细胞出现病变。感染的HSG细胞在细胞核、内质网、细胞质中出现数量不等的 3种不同形态的疱疹病毒样颗粒。宿主细胞中可检测到HCMVIE1/IE2的转录以及IE1/IE2蛋白的表达。

人巨细胞病毒感染对腮腺导管上皮细胞角蛋白K8和K18表达的影响

目的研究人巨细胞病毒（HCMV）感染对腮腺导管上皮细胞角蛋白K8和K18表达的影响。方法用免疫组化方法研究腮腺巨细胞包涵体病（PCID）石蜡包埋组织中巨细胞病毒立即早期抗原和角蛋白K8、K18的表达。结果PCID腮腺组织导管上皮出现包涵体巨细胞；包涵体巨细胞HCMV抗原DDG9／CCH2阳性；包涵体巨细胞角蛋白K8表达呈阴性，而K18表达呈强阳性。结论HCMV感染腮腺导管上皮细胞诱发角蛋白K8降解，K18表达上调是一种反应性改变；单层上皮角蛋白网具有维持上皮细胞机械力学完整性的功能。

昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞的诱导分化

目的研究正常昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞分化的诱导条件。方法取正常成年昆明小鼠胰腺导管上皮进行原代培养,利用细胞贴壁时间的差异在培养24、48、72 h连续换液除去腺体细胞,在含2%胎牛血清的培养条件下除去成纤维细胞,使可以在无血清培养基中生长的胰腺导管上皮样细胞形成优势生长。在此条件下培养并传代。取第三代细胞以无血清诱导培养基促使其分化。取诱导后3、5、7、14 d的细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。ELISA检测诱导生成的胰岛样细胞在高糖刺激下分泌胰岛素的功能。结果经过无血清诱导培养基诱导7 d后,胰腺导管上皮样细胞开始向胰岛素分泌细胞分化,胰岛素抗体染色阳性。14 d胰岛素抗体染色阳性细胞明显增多。该细胞在高糖刺激下可以分泌胰岛素。结论昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞经过无血清培养基诱导可以向胰岛样细胞方向分化。并且该胰岛样细胞在高糖刺激下具有分泌胰岛素的功能。

大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠胰腺岛管上皮细胞间接共培养向胰岛细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在适当条件下体外分化胰岛素分泌细胞的可能性。方法分离大鼠BMSCs及大鼠胰腺导管上皮细胞分别培养,在大鼠BMSCs培养过程中加入大鼠胰腺导管上皮细胞培养基中的上清部分,双硫腙(DTZ)染色观察诱导后的细胞着色情况,培养7d后进行了反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因的表达情况。结果将BMSCs进行分离和纯化,培养至第4代第6天时细胞形态一致,呈"水草"样排列,大鼠胰腺导管上皮细胞表达CK-19;混合培养基诱导的BMSCsDTZ染色阳性,RT-PCR检测有胰腺-十二指肠同源盒基因(PDX-1)及胰岛素(Ins)表达。结论适当的培养环境下,大鼠BMSCs具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。