转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验

目的通过转染Hath1基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞(greater epithelial ridge,GER)和小上皮嵴细胞(lesser epithelial ridge,LER)分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hath1基因,培养后做免疫组化染色观察。结果GER和LER体外培养并转染Hath1基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白(myosin Ⅶa)染色阳性,表达毛细胞的特异标记物,提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞。结论GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hath1后,可分化为毛细胞样细胞。

大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立

目的：建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系。方法：取P1大鼠耳蜗，分离出耳蜗上皮薄片组织，并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养，从而实现细胞的永生化。利用单克隆法纯化细胞系，并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定。结果：大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征：呈现上皮细胞样的多角形外观；不同世代的细胞均表达Isletl及SV40-LT抗原。该系目前已培养3个月，超过20代，传代时间为3～4d，传代比例为1：5。结论：本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系，这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能，特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础。

Atoh1过表达水平对异位耳蜗毛细胞样细胞的prestin表达及纤毛形态的影响

目的探讨Atoh1过表达水平对体外培养的耳蜗小上皮嵴区域毛细胞样细胞数量、prestin表达情况及其表面纤毛形态的影响。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗中圈进行体外培养,之后采用不同浓度的带有Atoh1基因的腺病毒(含报告基因EGFP)进行转染,检测腺病毒转染后不同时间点体外培养组织的Atoh1 mRNA相对表达量,同时观察小上皮嵴区域绿色荧光蛋白信号强度、毛细胞样细胞数量、毛细胞样细胞的prestin表达情况及其表面纤毛形态。结果带有Atoh1基因的腺病毒转染浓度越高,Atoh1的mRNA表达水平越高,小上皮嵴区域绿色荧光蛋白信号越强,同时该区域生成的毛细胞样细胞数量越多,表达prestin的毛细胞样细胞数量也越多(P<0.05),并且这些细胞表面静纤毛由低到高排列,形态更为规则。结论Atoh1过表达水平与诱导生成的能够表达prestin的异位耳蜗毛细胞样细胞数量正相关,并且Atoh1过表达水平越高,这些细胞的表面纤毛形态越规则。