不同生长阶段的小体鲟肌肉营养成分分析

小体鲟(Acipenser ruthenus)是中国一种商业价值较高的鱼类,为了探索其3个生长阶段的肌肉氨基酸组成状况,采集体重为(256.80±21.36)g(G_(1))、(478.93±23.12)g(G_(2))、(972.00±70.09)g(G_(3))3个阶段的小体鲟背部肌肉进行营养成分检测。结果表明,随着小体鲟的生长,肌肉水分含量呈低-高-低的趋势,为74.18%~76.46%,粗蛋白质含量在3个阶段之间差异不显著(P>0.05),为18.14%~18.48%,粗脂肪含量G_(3)阶段显著高于G_(1)、G_(2)阶段,为5.69%(P<0.05)。在氨基酸组成结果中,3个生长阶段的小体鲟均含有8种人体必需氨基酸,除色氨酸含量在小体鲟的3个生长阶段有显著差异外(P<0.05),其他必需氨基酸含量在小体鲟的3个生长阶段均无显著差异(P>0.05),必需氨基酸和总氨基酸含量随小体鲟的生长呈增加趋势;非必需氨基酸中,除谷氨酸含量有显著差异外(P<0.05),其他非必需氨基酸均无显著差异(P>0.05);在AAS和CS评价中,3种不同规格的小体鲟均以Met+Cys、Val为第一、第二限制性氨基酸。

小体鲟胚胎发育特征观察

观察了水温(18±1)℃条件下,小体鲟(Acipenser ruthenus Linnaeus)的胚胎发育特征。结果显示:成熟小体鲟卵圆球形、黑色、不透明,为粘性卵,卵径2.2～2.8 mm。水温(18±1)℃条件下,小体鲟受精卵历时110 h孵化出膜,所需总积温为2023～2308℃·h。小体鲟受精卵的卵裂方式为特殊的辐射状卵裂;原肠中期时动物极细胞覆盖胚胎三分之二;心跳期,心脏呈C型;尾端接近心脏时,眼囊内已经有色素沉着。根据胚胎发育过程的形态特征,可将小体鲟胚胎发育过程分为受精卵、卵裂、囊胚、原肠、神经胚、器官发生和出膜7个连续阶段,34个时期。另外,本研究还将小体鲟胚胎发育和鲟形目其他鱼类胚胎发育特征进行了对比分析。

小体鲟卵黄雌性蛋白分离纯化及抗血清的研制

采用凝胶柱层析法,对小体鲟(Acipenser ruthenusLinnaeus)卵黄蛋白粗提液进行分离纯化。小体鲟卵黄蛋白粗提液的质量浓度为25.04 mg/mL,经Sephadex G-200层析后出现3个蛋白峰。用聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹(Western-blotting)和免疫扩散等方法研究表明,小体鲟卵黄蛋白由分子量分别为132.1 kD、97.4 kD、85.9 kD、67.0 kD、59.2 kD、47.6 kD、30 kD、14.3 kD和12.8 kD的9个亚基组成;层析后峰B蛋白为卵黄雌性特异蛋白(yolk female specific protein,YFSP),是一种糖脂磷蛋白,具有雌性特异性和组织特异性,抗体具有种属特异性。Western-blotting结果表明,卵黄雌性特异蛋白(YFSP)与血清雌性蛋白(FSSP)免疫印迹图谱上都显示分子量为97.4 kD和30 kD的2条杂交带,可见两种蛋白在免疫原性上具有相似性。

小体鲟血清卵黄蛋白原和Ca^(2+)浓度与卵巢发育的关系

采用ELISA方法、分光光度计法和组织学方法,系统研究了不同年龄小体鲟(Acipenser ruthenus)血清卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)、血清钙离子(Calcium,Ca2+)含量与卵巢发育变化的关系。结果表明:血清Vg浓度、Ca2+浓度与卵巢的发育时期相关;在卵黄沉积期内,血清中Vg浓度与Ca2+浓度呈线性正相关(R2=0.9264);卵黄生成前期和沉积初期,血清中Vg浓度和Ca2+含量较低;卵黄沉积期内,卵母细胞由沉积初期的0.56mm增大到卵黄沉积末期的2.01mm,血清Vg质量浓度由110.65μg/mL上升到242.22μg/mL,血清Ca2+浓度由2.34mol/L增大到2.72mol/L。对同年龄的雌、雄小体鲟血清Vg浓度和Ca2+浓度测定表明,根据血清中Vg和Ca2+含量差别,可以区分出沉积期小体鲟的性别。

人工养殖施氏鲟和小体鲟精浆微量元素分析

采用原子吸收分光光度法测定了施氏鲟(Acipenserschrenckii)和小体鲟(Acipenserruthenus)的精浆中7种微量元素(K、Na、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn)的含量。施氏鲟分别取自宜昌和荆州,小体鲟取自宜昌。分析结果显示,不同种类和产地的鲟精浆中微量元素含量有差异,其中2条不同产地施氏鲟精浆Zn含量有显著性差异(P<0.05);施氏鲟和小体鲟精浆Na、K含量与我国主要淡水养殖鱼类有很大差异,在2种鲟精浆中Na与K浓度之比为10～14。

微卫星标记在人工养殖小体鲟种群的数据分析方法比较和遗传多样性分析

为获得可用于小体鲟Acipenser ruthenus种群遗传多样性分析的微卫星分子标记,采用跨种PCR扩增的方法从已发表的近缘种微卫星DNA标记引物中筛选得到13个具有多态性的位点,同时为了探讨更适合多倍体样品的微卫星数据读取方法,分别采用比例法和补齐法对微卫星数据进行分析。结果表明：两种数据读取方法的分析结果无显著性差异（P〉0.05）;本研究中选用补齐法对小体鲟种群遗传多样性进行分析,结果显示,小体鲟种群等位基因数（Na）从5个到30个不等,表观杂合度（H_O）范围为0.089 6-0.940 3,平均为0.648 0,期望杂合度（H_e）范围为0.085 2~0.912 6,平均为0.719 3,种群Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数（d）平均为-0.098 0,种群多态信息含量（PIC）平均为0.702 8;筛选得到的13个微卫星位点是适用于小体鲟种群遗传研究的具有多态性的良好分子标记。研究表明,被检测的小体鲟养殖种群存在一定程度的近交现象,建议通过引进不同来源亲本加以改善,以增加种群遗传多样性的丰富度。

水温对施氏鲟、小体鲟和西伯利亚鲟幼鱼生长的影响

在电子控温循环水系统中,研究不同水温(15℃、18℃、21℃、24℃和27℃)对56日龄的施氏鲟Acipenser schrenckii、小体鲟A.ruthenus和西伯利亚鲟A.baerii幼鱼生长的影响。结果表明,24℃组施氏鲟幼鱼的体长特定生长率(SGRL)显著高于其它温度组(P【0.05),而体质量特定生长率(SGRW)差异不显著(P】0.05);在18~27℃范围内,体长绝对增长率(AGRL)随温度的升高而降低,且显著高于15℃组(P【0.05)。18~24℃组的体质量绝对增长率(AGRW)显著高于15℃和27℃组(P【0.05)。在18~24℃范围内,施氏鲟幼鱼的体长相对增长率随温度的升高而增加,显著高于15℃和27℃组(P【0.05),最适生长温度为24℃。18℃组小体鲟幼鱼的SGRL显著高于其他温度(P【0.05),SGRW则差异不显著(P】0.05)。在15~27℃温度范围内,小体鲟幼鱼的AGRW升高后降低,其中18℃和24℃的SGRW分别为0.61g/d和0.64g/d,显著高于其他组。15℃组AGRL最低(1.6mm/d),显著低于其他组(P【0.05)。小体鲟幼鱼的最适生长水温范围为18~24℃,最适生长温度为18℃。在15~27℃范围内,21℃组西伯利亚鲟幼鱼的SGRL、AGRL和体长相对生长率均显著高于其他温度组(P【0.05),但27℃组存活率最低。西伯利亚鲟幼鱼的最适生长范围为15~24℃,最适生长水温为21℃。不同温度下,3种鲟幼鱼的肥满度变化不同,施氏鲟幼鱼的生长类型为强异速度生长,不同于小体鲟幼鱼与西伯利亚鲟幼鱼。在15~27℃范围内,3种鲟幼鱼的最适生长温度不同,在早期生长培育时应选用不同的培育温度。

小体鲟卵黄蛋白生化特性及合成途径的研究

使用葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)从小体鲟鱼卵粗提液中,提纯卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)和卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv)。卵黄脂磷蛋白(含糖、磷和脂,等电点7.50)具有雌性特异性,分子量为144kD,由97.4kD和30kD的大小2个亚基组成。卵黄高磷蛋白(含糖、磷,等电点8.30)其分子量为66kD,其具有两个亚基,分子量分别为47.6kD、16.8kD。制备卵黄脂磷蛋白兔抗血清,采用免疫组化方法对不同年龄小体鲟的肝脏、肠、卵(Ⅱ—Ⅴ期卵巢)及血涂片,进行免疫组织化学定位研究。小体鲟卵巢发育到Ⅳ期前,卵黄蛋白主要靠卵母细胞自身合成,这个时期内源性合成卵黄蛋白;当卵巢发育到Ⅳ期,卵母细胞自身不合成卵黄蛋白,主要是通过肝脏合成卵黄蛋白原,通过血液循环运送到卵巢,被卵母细胞吸收后,裂解为卵黄蛋白,这个时期外源性合成卵黄蛋白。

恩诺沙星对小体鲟和史氏鲟体内SOD活力影响的比较研究

在水温23℃、pH值6.5、溶氧10mg/L、氨氮含量小于0.1 mg/L和亚硝酸盐含量小于0.001 mg/L的条件下,将恩诺沙星按照0、20、40、60、80和100 mg/kg浓度,连续口服给平均体重50.0±5.0g的小体鲟(Acipenser ruthenus Linnaeus)及史氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)5 d,停药2d后测定其血浆及肝脏组织中过氧化物岐化酶SOD的活力,以期掌握不同恩诺沙星给药浓度下,两种鲟两种组织中SOD活力变化趋势,探讨分析该酶在药物代谢过程中的作用机制。结果表明:两种鲟两种组织内均含有一定量的SOD酶,且在对照组及所有给药组肝脏中酶活力均高于血浆中。不同给药浓度下,两种鲟两种组织中SOD活力均先受诱导升高,而后被抑制降低的变化趋势,且在40 mg/kg浓度组达到最大值。血浆中SOD活力受给药浓度影响较小,起伏较平稳,而小体鲟SOD活力始终高于史氏鲟。肝脏中SOD活力变化较剧烈,在低浓度组(<40 mg/kg)史氏鲟肝脏中SOD活力明显高于小体鲟,而在高给药浓度组(>40 mg/kg)则小体鲟略高于史氏鲟。

小体鲟HSP70基因全长cDNA序列的分离及表达分析

采用RT-PCR法首次从小体鲟(Acipenser ruthenus)肝脏RNA分离获得HSP70基因全长cDNA序列(HSP70cDNA)。生物信息学分析显示,小体鲟HSP70基因含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点,Ser、Thr、Thy磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥作用。经过BLAST比对,认为该序列与西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)、斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)、斑马鱼(Danio rerio)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲爪蟾(Xenopus lae-vis)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)、原鸡(Gallus gallus)、家鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的同源性均在80%以上,表明HSP70具有高度的保守性。组织表达分析表明,HSP70mRNA在小体鲟肝脏、心、脾、脑、肾、肌肉、胃、肠、垂体、精巢和卵巢组织中均有表达,但表达量不同,心脏、脾和肝脏中表达量高,脑、垂体和性腺中表达较少,鳃中没有表达。小体鲟HSP70基因的表达分析为研究应激条件下鲟科HSP70基因的差异表达和抗逆机理提供了基础。

小体鲟染色体核型及倍性的细胞遗传学研究

采用体内注射PHA和秋水仙素,肾细胞短期培养,常规空气干燥法制备小体鲟(Acipenser dabryanus Dumeril)的染色体,对肾细胞染色体数目统计分析表明,小体鲟染色体组是由116±4条染色体组成,核型公式为40m+34sm+26st+16t±mc,NF190±;采用德国PartecpasⅢ型流式细胞分析仪,以鸡红细胞为标准DNA(含量为2.3pg/N),测定小体鲟体细胞DNA含量为6.06pg/N,与染色体分析结果比较倍性一致。综合以上两项结果可以得出,小体鲟为四倍体鲟鱼。

小体鲟雌性亲鱼性腺不同发育时期消化酶分布及其活性的研究

采用酶学方法测定了不同性腺发育时期（Ⅱ~Ⅴ期）小体鲟Acipenser ruthenus Linnaeus雌性亲鱼胃、肠道和幽门盲囊中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性,并分析了3种酶活性随性腺发育时期的变化规律。结果表明：小体鲟雌性亲鱼5种消化器官中的蛋白酶活性以性腺发育Ⅱ期、Ⅲ期较高,淀粉酶活性以性腺发育Ⅴ期较高,脂肪酶活性以性腺发育Ⅴ期、Ⅱ期较高,3种酶活性均以性腺发育Ⅳ期较低;各性腺发育期,雌性亲鱼的蛋白酶活性均以幽门盲囊、后肠中较高,其次为胃、中肠,淀粉酶活性以中肠中最高,其次为胃、幽门盲囊、前肠、后肠,脂肪酶活性均以幽门盲囊中最高,其次为中肠、前肠、胃、后肠。研究表明,小体鲟雌性亲鱼在性腺发育Ⅱ期、Ⅲ期对食物中蛋白质和碳水化合物需求较高,而性腺发育周期中对脂类物质的需求Ⅴ期最高,其次是Ⅱ期,总体来说,小体鲟亲鱼在整个性腺发育时期对脂肪的需求量较高。

史氏鲟及小体鲟不同组织中溶菌酶水平的比较

对史氏鲟及小体鲟血清和几种主要组织的溶菌酶含量进行了测定和比较后发现,同小体鲟相比,史氏鲟的血清、鳃、肝、胃、前肠及后肠的溶菌酶量均较高,血清之间有极显著的差异,鳃、肝及后肠均有显著性的差别,胃及前肠之间无差异;小体鲟的粘液、幽门垂及脾中的溶菌酶含量较史氏鲟高,但无显著性差异,由此可见,虽然同为鲟科鲟属,溶菌酶在两种鱼之间的差别还是很显著的。

小体鲟仔、稚、幼鱼生物学及苗种培育技术初步研究

对小体鲟苗种生物学及培育进行了初步研究,摸索了此阶段适宜养殖的环境因子,并对其生长情况进行了测定,探讨了提高苗种培育关键时期(敏感期、转食期)成活率的技术可能性.本试验苗种成活率为56%.

西伯利亚鲟和小体鲟摄食前后耗氧率和窒息点变化与体重的关系

在水温22~25℃下,测定了不同体质量的西伯利亚鲟Acipenser baerii Brandt和小体鲟Acipenser ruthenus linnaeus在饱食和空腹情况下的耗氧率和窒息点。结果表明:西伯利亚鲟和小体鲟摄食后耗氧率与体质量关系的变化趋势与空腹情况时相同,均随体质量的增加而下降,饱食耗氧率与空腹耗氧率的比值随体质量的增加也下降,饱食与空腹西伯利亚鲟平均耗氧率与平均体质量的相关关系式分别为:Q=0.809*W-0.2414(0.179【Q【0.197;354【W【1873,R=0.9932)和Q=0.3786*W-0.1664((0.104【Q【0.146;351【W【2125),R=-0.9977)。小体鲟饱食与空腹时平均耗氧率与平均体质量的相关关系式分别为:Q=1.0323*W-0.2515(0.196【Q【0.613;8【W【955,R=0.9920)和Q=0.4427*W-0.1588((0.164【Q【0.345;8【W【1141),R=0.9210)。西伯利亚鲟和小体鲟的饱食和空腹窒息点也随体质量的增加下降。

小体鲟和俄罗斯鲟苗种培育技术初步研究

本文主要对小体鲟、俄罗斯鲟的苗种培育技术进行了初步研究，摸索了此阶段适 宜养殖的环境因子，并对其生长情况进行了测定。结果表明：在同一饲养条件下，小体鲟全 长、体重均超过俄罗斯鲟。苗种阶段成活率小体鲟为56％，俄罗斯鲟为49.6％。

小体鲟卵透明带家族ZP3亚型和ZPAX基因cDNAs克隆及其组织表达分析

为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。

小体鲟AR基因克隆、序列分析及其组织mRNA表达

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了小体鲟(Acipenser ruthenus)雄激素受体(AR)基因c DNA全长序列,应用real-time q PCR法对雌、雄个体不同组织中AR m RNA的表达进行检测。序列分析表明,AR基因c DNA全长为2 953 bp,包括5′端68 bp的非编码区(untranslation region,UTR),2 528 bp的开放阅读框ORF(open reading frame)和3′端327 bp的非编码区(不包括ploy A的尾巴)。AR前体蛋白由843个氨基酸组成,理论分子质量为94.24 k D。同源比较结果表明,小体鲟AR氨基酸序列与其他鱼类的AR氨基酸序列同源性较高,与杂交鲟(A.ruthenus×Huso huso)、西伯利亚鲟(A.baerii)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和日本鳗鲡(Anguilla japonica)的雄激素受体同源性分别为99%、98%、83%和83%。real-time q PCR分析小体鲟雌雄个体不同组织中的表达结果显示,AR基因在雌雄个体中相对表达基本相同,都是在性腺、肌肉和肾中高量表达,而在其他组织中少量表达。AR基因在小体鲟体内广泛表达,表明该基因可能对其生长和繁殖有重要作用。