小冰麦异附加系中携带BYDV抗性基因染色体的微分离及其文库的建立

采用微玻璃针法显微分离了小冰麦异附加系TAI 2 7中附加有中间偃麦草 (天蓝冰草 )的一对染色体 ,这对染色体上携带有抗大麦黄矮病的抗性基因。经过蛋白酶K消化和两轮寡聚核苷酸引物 PCR (degenerateoligonucleotideprimedPCR ,DOP PCR)扩增后 ,用TAI 2 7和中间偃麦草的总DNA为探针的Southern杂交证明PCR产物确是来自这对小染色体。第二轮PCR产物被连接至pGEM Tvector中并转化大肠杆菌 ,获得小染色体DNA文库。初步分析文库共有 2× 10 5个克隆子 ,插入片段长度在 2 50～ 12 0 0bp之间 ,平均 530bp ,其中单、低拷贝序列占 57% ,中、高拷贝序列占 4 3%。

小冰麦异附加系TAI-27中附加染色体上NBS同源序列的扩增

植物对病虫害的抗性主要是由抗病基因 (resistancegene ,R)决定的。目前已经克隆了 2 0多个R基因 ,大部分都属于NBS LRR类 ,这类基因编码NBS(nucleotidebind ingsite ,NBS)和LRR(leucine richrepeat ,LRR)两个比较保守的结构域。植物的NBS有几个保守区 ,本文根据其中的P loop和GLPL两个保守区设计了简并引物 ,通过PCR扩增NBS序列。在PCR扩增中使用的DNA模板是从小冰麦异附加系TAI 2 7中微分离的附加的单条染色体 ,这条染色体上携带BYDV (barleyyellowdwarfvirus ,BYDV)抗性基因。PCR扩增产物主要有三条带 ,2 0 0bp ,4 0 0bp和 950bp ,将其中的 2 0 0bp(nbsA )和4 0 0bp(nbsB)克隆到 pGEMT vector上并分别测序。 3个nbsA克隆的测序结果完全一致 ;对nbsB的 60多个克隆的不同酶切分析 ,只发现了一个克隆的酶切特性与其他不同。所以说 ,以单条染色体为模板PCR扩增产物组成比较简单 ,省去了RFLP作图的许多工作 ,可以为克隆R基因提供特异性探针。本文的实验设计将染色体微切割和微克隆技术与基因克隆联系在一起 。

小冰麦异附加系TAI系列中异源麦谷蛋白基因位点的生化与分子生物学鉴定

小冰麦异附加系TAI系列的每一个材料中分别附加了1对来自中间偃麦草的染色体,附加染色体很容易丢失,使得失去附加染色体的小麦可以作为异附加系的对照材料.通过分析TAI系列异附加系及各自对照材料的高分子量麦谷蛋白亚基组成与低分子量麦谷蛋白基因的PCR图谱,鉴定出异附加系TAI-13和TAI-25中具有编码中间偃麦草麦谷蛋白的基因位点,附加的中间偃麦草染色体属于第一同源群.异附加系TAI-11中附加的中间偃麦草染色体只具有低分子量麦谷蛋白基因位点.