小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建

目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,并检测其功能。方法针对小鼠TREM2基因设计合成3对sh RNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因sh RNA重组慢病毒载体(TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3)。用重组载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)后,进行滴度测定。取对数生长期BV2小胶质细胞,分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、sh RNA空质粒,空白组不做任何处理。感染120 h取各组细胞,Q-PCR法检测各组TREM2 m RNA,计算细胞沉默效率。结果 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T后镜下均观察到GFP,包装浓缩的慢病毒滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108) TU/m L。与空白对照组和阴性对照组比较,TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 m RNA相对表达量均降低(P均<0. 05);与TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-3感染组比较,TREM2-shRNA-2感染组TRME2 m RNA相对表达量降低(P均<0. 05)。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49. 4%±3. 98%、79. 7%±2. 01、65. 3%±2. 41%和39. 2%±6. 98%,TREM2-shRNA2组沉默效率最高。结论成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达,以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。

牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA筛选验证及慢病毒载体构建

旨在筛选在牦牛卵泡发育过程中可能吸附bta-miR-125b的长链非编码RNA(lncRNA),并构建双荧光素酶载体与慢病毒过表达载体,为研究调控牦牛生殖相关lncRNA的功能及机制提供基础。利用miRanda与RNAhybrid数据库预测可能靶向牦牛bta-miR-125b的lncRNAs,筛选出bta-miR-125b具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,由RNAhybrid进行结合位点预测,筛选出最优的lncRNA;采集牦牛卵巢分离卵泡并提取总RNA构建cDNA池,以RT-PCR技术扩增筛选所得lncRNA;在此基础上利用pmir-GLO载体构建技术构建该lncRNA野生型及突变型双荧光素酶报告载体,并将其与bta-miR-125b mimics共转染至293T细胞,检测双荧光素酶活性;最后利用慢病毒载体构建技术将测序正确的lncRNA与pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体同源区的片段同源重组,通过慢病毒包装系统(psPAX2:pMD2G)包装后感染293T细胞,计算感染效率及滴度。结果:两个数据库中的lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b存在紧密结合位点,扩增出lncRNA-ARS-UCD1.2的序列全长为1552 bp;双荧光素酶活性检测表明牦牛lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b mimic具有靶向关系(P<0.01);同源重组后经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,感染效率达(61.520±0.875)%,感染滴度为4×10^(8)TU/mL,表明lncRNA-ARS-UCD1.2过表达慢病毒载体成功构建。综上,本试验筛选出牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA,并验证了两者的靶向结合关系,同时成功构建了该lncRNA的过表达慢病毒载体,为下一步深入研究lncRNA在细胞中的功能机制奠定了基础。

人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

背景:慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具,但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道。目的:拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具。方法:根据人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Westernblot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果与结论:PCR扩增和测序结果显示,人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体。

钙网织蛋白-短发夹RNA慢病毒载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中钙网织蛋白表达的影响

目的构建钙网织蛋白(CRT)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,并检测其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT表达的影响。方法设计CRT特异性靶序列,合成含有靶序列的线性化载体pSIH1-H1-copGFP,通过转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2筛选基因表达效率最高的靶序列。包装生产CRT-shRNA慢病毒并测定滴度,转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测重组慢病毒载体对CRT基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。结果PCR阳性鉴定及测序分析结果显示,插入片段的序列及方向均与预期结果一致。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siRNA3的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的表达量均低于空白对照组(P﹤0.05)。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的基因表达效率均低于CRT siRNA3(P﹤0.05)。经测定,慢病毒载体的滴度为3.5×10^7 TU/ml,感染复数(MOI)=30时慢病毒转染至Hep-2细胞的转染率在90%以上。实时PCR结果显示,shRNA组中CRT基因的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05)。Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,shRNA组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT蛋白的表达水平明显下降。结论成功构建针对CRT的重组慢病毒载体可有效抑制喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT的表达,为后续研究CRT基因的功能提供了实验工具。

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。

新型小发卡RNA慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价

目的:设计用于表达新型小发卡RNA(sh RNA)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒(HBV)的可行性。方法:对慢病毒载体骨架SapⅠ位点进行突变,并将用于表达新型sh RNA的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向HBV保守序列的sh RNA并克隆到该慢病毒载体,包装含有sh RNA序列的重组慢病毒并定量,考察单个及多个sh RNA结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染HBV稳定转染肝细胞系Hep G2.CW(MOI=3),用杀稻瘟菌素筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板,于铺板96 h后取细胞上清检测HBs Ag、HBe Ag表达水平和HBV DNA的含量。结果:构建了一种用于表达新型sh RNA的慢病毒载体,并通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制;发现多个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一,值得进一步研究。

人Notch4基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺常见的恶性肿瘤,Notch4基因与SACC的发生、转移有关。文中构建人Notch4基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并鉴定。方法针对人Notch4基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,通过限制性内切酶MIu l和CIa l双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch4插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch4重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒4质粒系统共转染293 T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,用QRT-PCR和Western blot检测Notch4基因mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建慢病毒表达载体pLenOR-THM-Notch4,4质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度为6.2×108TU/ml。以复感染系数MOI(multiplicity of infection)为1感染293T细胞,感染效率在90%以上。结合QRT-PCR和Western blot检测结果,第2组慢病毒载体干扰效果最佳。结论成功构建并鉴定人Notch4 RNAi慢病毒表达载体。

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stb13感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度。结果测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存。系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml。结论成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。

慢病毒介导uPA-siRNA重组表达载体的构建及促进兔软骨细胞增殖

目的构建筛选出靶向特异uPA-siRNA慢病毒表达载体,感染软骨细胞后观察其对软骨细胞增殖及代谢的影响。方法根据siRNA原理设计、构建4对靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4),用RT-PCR筛选出高效靶向的P2序列。各序列经慢病毒包装后,通过Lipofectamine 2000转染入兔软骨细胞后,用RT-PCR和Western blot法分别检测uPA-siRNA对细胞内uPA mRNA和蛋白表达水平的抑制效果,用CCK-8法检测uPA-siRNA对软骨细胞增殖的影响。结果成功构建4对uPA-siRNA序列并筛选出用于后续实验的高效靶向P2序列,各序列经慢病毒载体包装并成功转染到原代软骨细胞中,在感染复数(MOI)为100时感染率达到85%以上。P1、P2、P3和P4均可抑制软骨细胞中uPA基因及蛋白的表达,但P2沉默效果最好,基因抑制率达到70%,感染后软骨细胞的增殖受到促进。结论成功构建高效靶向uPA-siRNA慢病毒载体,证实其可稳定转染软骨细胞并高效抑制uPA基因表达并促进软骨细胞增殖。

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。

shRNA-SIVA1慢病毒载体的构建及其对胃癌细胞耐药性的影响

目的构建shRNA⁃SIVA1慢病毒表达载体,研究其对胃癌SGC⁃7901/DDP细胞耐药性和增殖的影响以及可能的机制。方法根据GenBank数据库提供的SIVA1基因序列,设计3条SIVA1靶点干扰序列;引物退火形成双链DNA,与经过双酶切的线性化GV493载体连接并转化;在293T细胞中进行病毒包装并测定病毒滴度;将重组慢病毒转染人胃癌SGC⁃7901/DDP细胞,qRT⁃PCR和Western blot检测细胞SIVA1 mRNA和蛋白表达水平,CCK⁃8法检测细胞对顺铂(DDP)的敏感性变化以及细胞增殖的情况,Western blot检测细胞Bcl⁃2和Bcl⁃xL蛋白表达情况。结果测序结果显示,设计的干扰序列正确插入GV493载体,成功构建shRNA⁃SIVA1重组载体;慢病毒载体在293T细胞完成包装,病毒滴度为2×109 TU/mL;qRT⁃PCR和Western blot结果显示,慢病毒载体转染SGC⁃7901/DDP细胞后,能显著降低SIVA⁃1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.005);CCK⁃8实验结果显示,沉默SIVA1后,细胞对DDP的敏感性显著下降(P<0.005),同时细胞的增殖活性显著升高(P<0.01),并且凋亡抑制分子Bcl⁃2和Bcl⁃xL的蛋白表达增加。结论成功构建了靶向人SIVA1基因的shRNA⁃SIVA1慢病毒表达载体,干扰胃癌细胞的SIVA1表达可增强细胞对DDP的抵抗并促进细胞增殖活性,这一现象可能与凋亡抑制分子Bcl⁃2和Bcl⁃xL的表达升高有关。

携带DREAM基因shRNA的慢病毒载体的构建及其对坐骨神经缩窄损伤大鼠的镇痛作用

目的:构建含下游调控元件的拮抗分子(downstream regulatory element antagonistic modulator,DREAM)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,利用RNA干扰技术抑制DREAM基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。方法:将靶向大鼠DREAM基因的shRNA重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装成慢病毒,收集病毒上清并进行载体病毒滴度的测定。将纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠36只随机分为6组:正常对照组(N)、假手术组(S),根据干预手段的不同将大鼠坐骨神经缩窄损伤(chronic constriction injury of sci-atic nerve,CCI)模型组分为4组:CCI(C0)组,CCI疼痛模型建立后不给任何干预措施,生理盐水对照(C1)组,空白载体对照(C2)组,LV-shRNADREAM慢病毒载体治疗(C3)组。该3组大鼠于CCI后第7天分别于蛛网膜下腔注射生理盐水、空白载体、LV-shRNADREAM慢病毒载体。观察各组大鼠术后3,7,10,14,21 d的疼痛行为学的改变。实验结束取腰段脊髓荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA含量、Western印迹测定DREAM蛋白含量。结果:测序分析证实载体构建成功,成功进行慢病毒包装,得到病毒液滴度为1.0×108IFU/mL慢病毒载体。鞘内注射LV-shRNADREAM慢病毒载体后,CCI大鼠热痛阈和机械痛阈的异常明显得到改善(P<0.01),腰段脊髓神经细胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表达均显著降低(P<0.01)。结论:成功构建了携带大鼠DREAM基因有效shRNA的慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰脊髓中DREAM的表达,为神经病理性疼痛的治疗提供了实验基础。

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.

靶向 survivin 基因的 shRNA 慢病毒载体的构建及其对膀胱癌 EJ 细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.

慢病毒介导的c-met RNA干扰对人乳头状甲状腺癌K1细胞生物学行为的影响

目的:探讨c-Met在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达;构建针对人c-met基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察其对K1细胞c-met基因的沉默效应及对细胞生物学行为的影响。方法:免疫组化方法检测35例乳头状甲状腺癌及25例良性甲状腺疾病手术切除标本中c-Met的表达;构建人c-met基因的RNAi慢病毒载体,应用荧光定量RT-PCR与Western blotting检测其对c-met的干扰效率,应用克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验检测其对细胞克隆形成、周期、迁移、侵袭能力的影响,应用裸鼠模型评估RNA干扰后细胞成瘤能力的影响。结果:c-Met在PTC中的表达明显高于良性甲状腺组织;成功构建了c-met RNAi慢病毒载体,RT-PCR及Western blotting实验显示其对乳头状甲状腺癌K1细胞c-met mRNA及蛋白表达的抑制均较明显;克隆形成实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测显示c-met RNAi慢病毒载体能够减少S细胞比列;划痕实验及Transwell实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制细胞迁移和侵袭;裸鼠成瘤实验显示RNA干扰后细胞的成瘤能力降低。结论:c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力、细胞周期进程、迁移、侵袭及成瘤能力。

慢病毒载体介导siRNA对人喉癌抑瘤作用的实验研究

目的研究慢病毒载体介导siRNA抑制survivin基因表达后对人喉癌hep-2细胞体内增殖能力的影响以及对裸鼠移植人喉癌的抑瘤活性。方法应用裸鼠成瘤实验测定致瘤能力的改变,采用RT-PCR和Western blotting测定干扰后survivin基因及其蛋白的表达水平;流式细胞术检测喉癌细胞凋亡指数和增殖指数。结果靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,使survivin-mRNA表达减少60%-85%,蛋白表达减少70%;流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高(P<0.01),降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论RNA干扰survivin基因表达后明显抑制了人喉癌hep-2细胞的体内增殖能力;siRNA介导的survivin基因下调可明显抑制肿瘤细胞在体内的生长。

Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。