脐动脉在搏动流作用下脱细胞制备小口径组织工程血管支架的研究

探索利用搏动流对小口径血管进行脱细胞的方法。首先将脐动脉连接到搏动流管道中进行灌注,结合0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合溶液的共同作用,以1%十二烷基硫酸钠为脱细胞试剂对脐动脉洗脱3h。洗脱3h后的病理切片显示脐动脉细胞被全部脱去;拉伸实验测定脐动脉脱细胞前极限应力为(3.55±0.42)N,脱细胞后其极限应力为(3.50±0.43)N(P>0.05);在300mmHg压强作用下,脐动脉脱细胞前后两组(各30根血管)均有2根破裂,28根保持完好(P>0.05)。此结果预示,脐动脉在脱细胞前后的力学特性无显著差异。成纤维细胞静态培养显示,成纤维细胞能在脱细胞脐动脉支架表面良好生长。研究结果表明利用搏动流将小口径血管脱细胞是一种简便、快速、有效的方法。

小口径组织工程血管基质材料的生物学和力学评价

目的研制一种具备正常血管的生理结构和良好的生物相容性,而且具有血管力学特性的小口径组织工程血管基质材料,并按医用输血材料的力学及生物学国家标准评价。方法以去细胞生物衍生材料作为基质,按照国家标准对其进行力学和生物学评价。结果血管的轴向、径向拉伸应力分别为23.14 N和36.79 N,均大于标准规定的7.5 N;拉伸率分别为95.19%和80.24%,大于标准规定的20%。血管的缝合强度为13.71 N,不小于0.5 N,血管符合力学规定。生物学检测主要用血管或其浸提液检测血管的pH值在对照去离子水pH(7.52±1.5)范围内、溶血率1.397 2%,小于5%、全血凝固时间比对照长50%、对细胞毒性为0级,皮内注射无刺激。结论血管基质材料具有良好的力学及生物学性能,它将在小口径血管替代治疗中起重要作用。

流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化

背景:细胞内皮化的流动剪切力大小和作用方式是小口径组织工程血管的构建中的关键问题。小口径组织工程血管构建后的抗血流冲击能力是决定移植成功的关键因素之一,较多人把研究重点集中在如何制作移植血管支架材料,如何提高宿主细胞种植后其血管内壁的抗凝效果,而对细胞内皮层的力学驯化则关注较少,该方法有可能是提高组织工程血管移植成功率的有效手段之一。目的:比较单一水平和成梯度增加的流动剪切力对组织工程血管内皮化的影响,获得适用于组织工程血管内皮化的剪切力大小和加载方式。方法:采用血管铺片硝酸银染色法和内皮细胞肌动蛋白荧光标记法,观察组织工程血管内壁上内皮细胞的数量、形状和黏附性能等变化情况。结果与结论:经2.5和3.0 N/m^2剪切力作用2 h后,血管内壁上的内皮细胞几乎全部脱落;而经0.5-3.0 N/m^2,每2 h增加0.2 N/m^2的成梯度增加的剪切力作用后,血管内皮细胞层保持较完整,细胞形态成明显的轴向排列,且能诱导内皮细胞中应力纤维的出现。说明成梯度增加的流动剪切力这种"驯化"方式,能较好地促进小口径组织工程血管的内皮化。

不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化

背景:临床上迫切需要小口径人工血管来治疗冠状动脉和外周动脉疾病,目前,血管组织工程已成为制备小口径人工血管的主要方法,选择合适的生物材料和细胞来源是小口径组织工程血管构建成功的关键因素。目的:观察4种静电纺丝膜材料对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化为血管平滑肌细胞的影响。方法:分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分别接种于聚己内酯(PCL)、聚己内酯-透明质酸(PCL-HA)、聚己内酯-丝素蛋白(PCL-SF)、聚己内酯-明胶(PCL-GEL)静电纺丝膜材料上,培养1,3,7 d后,扫描电镜下观察材料上的细胞排布,鬼笔环肽染色观察材料上的细胞增殖与黏附,qRT-PCR检测材料上细胞分泌的CD90、Meflin、转化生长因子βmRNA表达;向血管平滑肌细胞诱导分化7 d后,qRT-PCR检测材料上细胞ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上均沿着静电纺丝膜的纤维走向排列;②鬼笔环肽染色显示,骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上分布规律,均沿着纤维走向呈现平行分布,并且PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL静电纺丝膜较PCL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附,PCL-SF静电纺丝膜相较于PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附;③qRT-PCR检测显示,4种静电纺丝膜材料均可维持骨髓间充质干细胞CD90和Meflin的mRNA表达,组间比较差异无显著性意义(P>0.05);PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL组培养1,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL组(P<0.05),PCL-SF组培养3,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组培养7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL-GEL组(P<0.05);④qRT-PCR检测显示,PCL-SF组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于PCL组(P<0.05);⑤结果表明:相较于PCL、PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜,PCL-SF静电纺丝膜与骨髓间充质干细胞结合更适合制备小口径组织工程血管。

人脱细胞脐动脉支架与兔骨髓内皮祖细胞构建组织工程血管的实验研究

目的:构建小口径组织工程生物血管并观察移植于兔颈动脉后的通畅情况。方法 :制备人脐动脉脱细胞支架,随机分为三组:Ⅰ.实验组:将兔皮肤成纤维细胞、下肢动脉平滑肌细胞和骨髓内皮祖细胞依次接种于纤维连接蛋白包被的血管支架上;Ⅱ.对照组:血管支架未经纤维连接蛋白包被,种植细胞种类同实验组;Ⅲ.裸支架组:未经处理的脱细胞裸支架。行HE染色观察种植细胞情况;免疫组化染色鉴定种植细胞的表型;电镜下观察人工血管内皮细胞间的连接状态。将人工血管分别移植于兔颈动脉,术后0h、2h、1d、2d、3d、7d、14d及30d后行血管超声检查,对三组移植血管通畅程度进行比较。结果:植入细胞后的人工血管动态培养2w后,Ⅰ组血管在倒置显微镜可见管腔内大量细胞附着、细胞呈密集环绕生长,HE染色结果显示:血管管腔内层均匀覆盖细胞;免疫组化染色其结果显示:管腔内层细胞高表达成熟内皮细胞表面标志CD34;扫描电镜观察血管腔内较为均匀的覆盖细胞,血管壁较为光滑呈膜性结构。Ⅱ组血管在倒置显微镜下和HE染色均未见附着的细胞;免疫组化染色显示管腔内层细胞不完整;扫描电镜观察血管腔内少量细胞覆盖,血管壁为不规则的纤维状结构。兔颈动脉移植术后立即行血管超声检测,结果显示实验组血管的内径为(3.97±0.2)mm,血流通畅,与裸支架组的(3.88±0.2)mm及对照组的血管内径(4.14±0.6)mm相比,差异无统计学意义(P>0.05);2h血管超声检测结果显示,实验组(3.81±0.7)mm与对照组(1.89±0.2)mm的血管内径有显著性差别(P<0.05),后者明显狭窄,出现血栓。30d后实验组血管内径(2.50±0.2)mm与移植0h比较显著狭窄(P<0.05)。结论:人脐动脉脱细胞支架与兔骨髓内皮祖细胞构建的组织工程生物血管移植于兔颈动脉可长期通畅。

氯化镁缓释抗钙化组织工程小口径血管体外性能测试

目的构建氯化镁(MgCl_(2))微米缓释抗钙化的组织工程小口径血管。方法联合应用Triton X-100+脱氧胆酸钠盐、DNA/RNA核酶对绵羊颈动脉行脱细胞处理,制成组织工程小口径血管支架,HE染色,电镜下观察脱细胞情况和血管支架性能。采用复乳法超声破碎高速搅拌挥发法,制备载有MgCl_(2)的微米抗钙化缓释微球颗粒。检测缓释微球的粒径、包封率、载药量(率)及测出缓释曲线。应用碳二亚胺盐酸盐/琥珀酸亚胺(EDC/NHS)交联人工小口径血管,采用冷冻干燥技术将载有MgCl_(2)的微米缓释微球与血管支架结合,电镜下观察结合情况。检测标本血管厚度、拉力强度和压力承受值。结果羊颈动脉经脱细胞处理后能去除各类细胞,并保持支架原有性能。载有MgCl_(2)的微米抗钙化缓释微球粒径(1.31±0.02)μm,相对均匀,微球颗粒包封率82.79%,载药量(率)2.98%,25天内存在缓慢释放,释放率达81.08%。载有MgCl_(2)的缓释微球颗粒与小口径组织工程血管能有效紧密结合。结论以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体制成的载有MgCl_(2)的缓释微球颗粒可缓释镁离子,这为构建抗钙化组织工程小口径血管奠定了基础。

不同处理条件下人脱细胞脐动脉组织结构和生物力学性质的对比研究

目的:研究不同处理方法对人脱细胞脐动脉的组织结构影响,并比较其生物力学性质,为小口径组织工程人工血管支架的选择提供依据。方法:搏动条件下采用酶消化法脱去人脐动脉中的细胞成分(n=10),将每根脱细胞脐动脉平分为3段,随机均分为3组,A组经0.9%氯化钠液、B组经75%乙醇、C组经0.5%戊二醛处理。对处理后的脱细胞脐动脉进行HE染色、弹力纤维染色、生物力学检测(抗张力测试和抗爆破压测试),并进行比较。结果:脱细胞脐动脉经3种处理后B组及C组的塑形性较A组好;力学测试结果显示抗张力强度C组最大(4.63±1.06)N,B组次之(2.20±0.43)N,A组最小(0.93±0.33)N(P<0.05);抗爆破压强度B组(257±23)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),C组(261±23)mmHg无差异,均大于A组(143±19)mmHg(P<0.05);从位移-负荷曲线分析,C组的斜率最大,B组次之,A组最小;HE染色结果显示B组、C组脱细胞脐动脉的弹力纤维板形态能够很好地保存下来,而A组的弹力纤维板不明显;3组血管经抗张力测试,纵向拉伸或抗爆破压测试后,再采用弹力纤维染色进行形态学观察,A组的弹力纤维断裂比较明显,B组弹力纤维断裂较A组少,但较C组的断裂多。结论:使用75%乙醇或0.5%戊二醛处理后的脱细胞脐动脉塑性好,组织结构的形态佳、生物力学性质均明显较0.9%氯化钠液处理组好,而75%乙醇处理后的脱细胞脐动脉,在其柔韧性方面较0.5%戊二醛处理后更接近于生理状态,因此75%乙醇处理后的脱细胞脐动脉可能是较理想的血管支架材料。