小型猪肝脏细胞色素P450基因CYP3A29克隆与序列分析

设计引物通过RT-PCR扩增巴马香猪和贵州小型猪香猪药物代谢关键P450基因CYP3A29基因的全长编码区,纯化并克隆入pMD 18-T载体,通过序列测定和比对分析其序列变异情况。17头小型猪共发现CYP3A29基因的5个单核苷酸变异位点,均表现为同义替换,对编码的氨基酸序列无影响;猪CYP3A29的单核苷酸变异和品系相关,在不同品系中可表现出品系特有的单核苷酸变异;贵州小型香猪G3 a2902发现1个可变剪接,缺失89 bp并产生移码,改变编码蛋白。本研究克隆的巴马香猪和贵州小型香猪CYP3A29基因及其序列变异情况,可为其作为药物代谢模型的应用提供技术资料。

小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88(GenBank登录号:EF625347)的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。

重组CYP3A46细胞微粒体体外药物代谢动力学分析

通过对巴马小型猪CYP3A46重组细胞微粒体体外药物代谢动力学特征比较分析,为巴马小型猪应用于临床前药理试验提供科学依据。分析重组CYP3A4、CYP3A46细胞微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50)、Clint及IC50均表明:CYP3A46的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均比较接近CYP3A4(P>0.05),CYP3A46是否是CYP3A4的同源酶需要进一步研究确定。

CYP3A29稳定表达HepG_2细胞株的建立及其硝苯地平代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪CYP3A29的HepG2细胞株。方法通过总RNA提取、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A29的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体PMD18-T上得到重组质粒pMD-3A29;以测序正确的重组质粒pMD-3A29为模板,采用PCR扩增CYP3A29基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHI/XhoI双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A29基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,并测序验证;将测序正确的CYP3A29基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,经RT-PCR及Western-blot分析及探针药物硝苯地平对重组细胞进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A29细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A29的HepG2细胞株,可用于相关药物代谢研究。

CYP3A22稳定表达HepG_2细胞株的建立及其探针药物代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪细胞色素CYP3A22的HepG2细胞株。方法通过从Bama小型猪肝组织中提取tRNA、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A22的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体pMD18-T上得到重组质粒pMD-3A22;以测序确定的重组质粒pMD-3A22为模板,采用PCR扩增CYP3A22基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A22基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,测序表明,CYP3A22基因真核表达载体正确构建;将测序正确的CYP3A22基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,RT-PCR及Western blot分析,并用探针药物硝苯地平对重组细胞进行进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A22细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A22的HepG2细胞株,可用于相关的药物代谢研究。