一株野生卵孢小奥德蘑菌株的鉴定与驯化栽培

在湖南省长沙市岳麓山采集到1株野生蘑菇,采用组织分离法获得纯培养菌株HCS,以卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)商业栽培菌株H1为对照,结合形态学和ITS序列分析对其进行鉴定,通过菌丝培养确定HCS菌丝最适生长温度,测定菌丝漆酶与过氧化物酶活性,对其进行覆土栽培驯化,观测其出菇特性与子实体农艺性状。结果表明:通过形态学分析,结合分子鉴定,确定HCS为卵孢小奥德蘑;HCS菌丝最适生长温度为24℃,菌丝漆酶活性为77.55 U/g,过氧化物酶活性为4680.15 U/g,均显著高于H1的,其中过氧化物酶活性是H1的2.56倍;HCS菌丝满袋时间为37 d,覆土后第38天开始出现幼菇;HCS整体菇形健壮,单菇鲜质量14.75 g;子实体菌盖厚度16.30 mm,菌盖直径31.77 mm,菌柄长度54.17 mm,菌柄直径14.07 mm,菌柄基部直径19.87 mm,菌柄颜色为浅褐色;HCS栽培过程中无菌包污染,其抗性强于栽培菌种H1的。综上可知,HCS是一种优异的种质资源,具有进一步开发利用的价值。

卵孢小奥德蘑抗哈茨木霉菌株的筛选研究

以全国收集的26株卵孢小奥德蘑菌株为试材,采用人工抗逆境驯化和原生质体育种方法,研究了卵孢小奥德蘑菌株在逆境下的生长特性,以期为卵孢小奥德蘑优良菌株选育提供参考依据。结果表明:对采集的26株卵孢小奥德蘑菌株,经过(26℃,16 h;30℃,8 h)、(26℃,16 h;32℃,8 h)、(26℃,16 h;34℃,8 h)、(26℃,16 h;36℃,8 h)条件下进行耐高温菌株驯化,筛选出Sgw、H08gw、Lgw、Qgw、H09gw、H01gw等6株耐高温菌株;通过卵孢小奥德蘑菌株与哈茨木霉菌株的对峙试验,筛选出对木霉抗性较强的F2、Sgw、Lgw 3株菌株;以耐高温驯化菌株(Sgw、H08gw)、抗木霉菌株(F2、Sgw、Lgw)为母本进行原生质体融合,并在(26℃,16 h;32℃,8 h)条件下再生,筛选出4株抗逆性较强菌株Y1、Y4、Z1、Z9;经出菇验证,菌株Y4、Y1、Sgw耐高温,产量高,抗木霉污染。经对抗逆性菌株酶活性指标测定、抗性菌株转录组分析,发现抗木霉菌株菌丝细胞代谢能力,催化活性,细胞结构体等功能发生了变化,并通过信号转导、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、过氧化物酶体等代谢通路,以达到抵御哈茨木霉侵染和高温胁迫的作用。Y4、Y1、Sgw菌株为该研究筛选的最终优良菌株,可作为生产上进一步优化培育。

卵孢小奥德蘑覆土中有益细菌筛选与鉴定

采用稀释涂布平板法分离培养卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)覆土中的细菌,通过对峙培养法筛选能够促进卵孢小奥德蘑菌丝生长的细菌,并检测其溶磷、固氮、解钾及产生纤维素酶、生长激素和嗜铁素等生物活性,综合利用形态特征、生理生化特性及分子系统学方法鉴定有益细菌。结果表明:从覆土中分离获得256株细菌,其中8个属的54株细菌能够促进菌丝生长;芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas)为优势属,占比分别为42.59%和25.93%;在54株细菌中,有14、8、6株细菌分别具有溶磷、固氮、解钾活性;有10、9、7株细菌分别能够产生纤维素酶、生长激素、嗜铁素。有益细菌54-14、41-60、57-71和27-17分别鉴定为荧光假单胞菌(P. fluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。

卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌的鉴定与生物学特性研究

卵孢小奥德蘑Oudemansiella raphanipes是近年来成功驯化栽培的一种食药兼用的珍稀菌类,近年来随着其栽培面积的不断扩大,病害发生也越来越严重。作者在北京某卵孢小奥德蘑种植基地发现疑似蛛网病,为明确其病原菌,对发病子实体进行了病原菌分离,并综合其形态学特征、多基因系统发育分析和柯赫氏法则验证的结果,将卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌鉴定为金黄菌寄生Hypomyces aurantius(无性阶段为异形枝葡霉Cladobotryum varium)。该病原菌菌丝生长的最适温度为20℃,最适碳源为木屑,最适氮源为黄豆粉,最适pH为6,光照对菌丝生长有一定的抑制作用;产孢最适温度为20℃,最适pH为8,最适氮源为麸皮,最适碳源为木屑;孢子萌发的最适营养液为0.2%葡萄糖溶液,最适温度为25℃,最适pH为6。研究结果为进一步明确卵孢小奥德蘑蛛网病的发生规律,制定科学的防治策略奠定了基础。

黏小奥德蘑生物学特性及驯化

在西藏自治区林芝市察隅县慈巴沟风景区采集得到野生子实体,采用组织分离法获得纯培养菌株,并结合形态学和ITS序列分子系统发育分析进行物种鉴定,通过菌丝培养确定最适碳源、氮源、pH和温度,选用3种栽培料配方驯化,统计每袋子实体数量,称量单菇鲜重。结果表明:通过组织分离纯化获得菌株XZNM-NX01,将该菌株鉴定为黏小奥德蘑(Mucidula mucida);培养最适碳源为蔗糖,最适氮源为牛肉膏、酵母膏,最适pH为5~6,最适温度为26℃;采用3种栽培料均可出菇,以配方B为栽培料时,每袋子实体个数比配方A和C多,为10左右,且单菇鲜重也高于配方A和配方C,为(16.28±2.01)g。

拟黏小奥德蘑的分离鉴定及生物学特性

在云南省昆明市石林彝族自治县圭山镇圭山国家森林公园采集得到野生小奥德蘑属(Oudemansiella sp.)标本,采用组织分离法获得纯培养菌株,并结合形态学和ITS序列分子系统发育分析进行物种鉴定,采用单因素结合正交实验分别对固体和液体培养条件进行筛选优化,采用袋料覆土栽培,在温度20~28℃、土壤湿度40%、空气湿度80%~90%的自然光照条件下的田间大棚开展驯化。结果表明:通过组织分离法获得纯培养菌株JF2004,将标本鉴定为拟黏小奥德蘑(O.submucida);固体培养最佳条件为20.0 g·L^(-1)果糖、16.0 g·L^(-1)琼脂粉、2.0 g·L^(-1)酵母膏、0.5 g·L^(-1)碳酸钙、0.01 g·L^(-1)维生素B_(1),温度26℃,pH 8.0;液体培养最佳条件为20.0 g·L^(-1)可溶性淀粉、2.0 g·L^(-1)酵母膏、0.5 g·L^(-1)磷酸氢二钾、0.01 g·L^(-1)维生素B_(1),温度28℃,pH5.0;接种后约23 d菌丝满袋,覆土后第24天子实体成熟,栽培子实体与野生子实体相比,菌盖直径较大、颜色较浅;野生子实体菌环明显,而栽培子实体菌环较小或无菌环;野生子实体菌柄基部颜色变深,而栽培子实体通体白色,菌柄没有颜色变化。

卵孢小奥德蘑菌株的拮抗及ISSR遗传分析

鉴定卵孢小奥德蘑菌株的亲缘关系,以期为卵孢小奥德蘑菌株新品种选育、优质种源筛选提供依据。引进国内不同地区的卵孢小奥德蘑菌株15个,通过拮抗试验和ISSR分子标记对15个菌株进行鉴定和遗传多样性分析。结果表明:供试菌株之间的拮抗反应有一定差异,其中有44组产生拮抗反应,61组没有产生拮抗反应;ISSR分子标记分析结果表明,供试菌株在相似性72%水平上,聚为7大类群;结合拮抗反应和ISSR分析,15个卵孢小奥德蘑菌株具有较的遗传差异和遗传多样性,其中菌株2、3亲缘关系较近且聚成一类,菌株1、6、14均单独聚成一类,与其他菌株有较大差异,可作为育种的备选亲本菌株。

超声波提取卵孢小奥德蘑多糖的工艺优化

目的:明确利用超声波提取法提取冻干卵孢小奥德蘑多糖的最优工艺条件。方法:以卵孢小奥德蘑多糖的提取率为指标,采用单因素和正交试验方法,研究超声温度(℃)、超声时间(min)、超声功率(W)、料液比,对卵孢小奥德蘑多糖提取率的影响。结果:影响卵孢小奥德蘑多糖提取率的先后顺序为料液比>超声温度>超声功率>超声时间,卵孢小奥德蘑多糖提取的最优参数为超声温度40℃、超声时间20 min、超声功率180 W以及料液比1∶40,在此条件下卵孢小奥德蘑多糖的提取率为5.64%。

鳞柄小奥德蘑多糖提取工艺的优化及抗氧化活性

研究鳞柄小奥德蘑多糖的最佳提取工艺及其体外抗氧化活性。采用正交实验法优化提取工艺,蒽酮-硫酸法和3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定多糖含量,分别采用普鲁士蓝法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法测定鳞柄小奥德蘑多糖的抗氧化能力。研究结果显示,影响鳞柄小奥德蘑粗多糖得率的主次因素为:料液比>提取时间>提取温度>提取次数,多糖的最佳提取工艺为:料液比1∶40,提取时间1 h,提取温度90℃,提取次数3次。在最佳提取工艺条件下,水提法提取鳞柄小奥德蘑粗多糖的得率约8.84%。体外抗氧化活性测定结果表明,鳞柄小奥德蘑粗多糖对·OH的清除效果比较明显,随着质量浓度的升高,清除效果越发显著(p<0.05),4 mg/m L的粗多糖对·OH的清除率达48.94%±12.32%;鳞柄小奥德蘑粗多糖具有一定的还原能力;对O-2·的清除能力较弱。因此,鳞柄小奥德蘑中粗多糖的含量较高且具有一定的抗氧化能力,可用于开发研制多糖药物和保健性食品等深加工产品。

野生拟粘小奥德蘑驯化和栽培研究

对采自湖南的野生拟粘小奥德蘑(Oudemansiella submucida)进行驯化栽培。试验结果表明:拟粘小奥德蘑菌丝最适生长温度为23℃,菌丝生长湿度范围为75%～95%;在培养料上避光培养,第一潮菇生物学效率达96.1%以上,二潮菇生物学效率达49%。

热带小奥德蘑培养与驯化

对采自云南的热带小奥德蘑(Oudemansiella canarii)菌株进行驯化培养。结果表明:热带小奥德蘑菌丝生长的适宜温度为28℃,最适宜pH为8.5;热带小奥德蘑可以在棉籽壳、木屑为主料的培养料(50%棉籽壳、30%木屑、18%麸皮、石灰2%,pH自然,含水量65%～70%)上生长,一般从接种到子实体采收完成约65～71 d,生物学效率为122.66%±5.11%。

鳞柄小奥德蘑两变种栽培比较

成功的实现了鳞柄小奥德蘑两变种的人工栽培 ,其中鳞柄小奥德蘑双孢变种为首次报道。就鳞柄小奥德蘑原变种和鳞柄小奥德蘑双孢变种的菌株进行了对比栽培研究。结果表明 ,鳞柄小奥德蘑原变种菌株 2 85和鳞柄小奥德蘑双孢变种菌株 2 2 3在菌丝最佳生长温度、最适出菇温度、采菇期及生物效率等方面存在差异 ,在云南前者适合于夏季栽培 ,而后者则适于秋。

褐褶边小奥德蘑生物学特性及驯化栽培

对采自辽宁省老秃顶子国家级自然保护区的野生褐褶边小奥德蘑(Oudemansiella brunneo-marginata)进行生物学特性和驯化栽培探究。试验结果表明,褐褶边小奥德蘑在阔叶树木屑加富培养基(配方4:200g马铃薯,200g阔叶木屑,20g葡萄糖,3g磷酸二氢钾,1.5g硫酸镁,15g琼脂,1000mL蒸馏水,pH自然)上生长较好,适宜碳、氮源分别是葡萄糖、蔗糖和蛋白胨,适宜pH为7;在3种供试培养料中均能形成子实体,其中在阔叶树木屑培养料中(78%阔叶树木屑,20%麸皮,1%石灰,1%白砂糖,60%左右含水量)发菌最快,形成原基最早、数量最多。

鳞柄小奥德蘑多糖对巨噬细胞免疫功能的调节作用

研究鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用。采用灌洗腹腔法收集小鼠巨噬细胞,建立其体外培养体系;采用鸡血红细胞法、荧光探针标记、总一氧化氮检测和酶联免疫吸附试验等方法分别检测巨噬细胞吞噬能力、NO合成量、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6和白细胞介素-12等的分泌量。结果显示,与空白对照组相比,鳞柄小奥德蘑多糖能显著增强体外培养和腹腔内巨噬细胞的吞噬能力和NO合成量,增加体外培养的小鼠巨噬细胞对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6和白细胞介素-12等细胞因子的分泌量。因此,鳞柄小奥德蘑多糖可能通过提高细胞对NO和多种免疫相关信号分子的分泌量,增强细胞的吞噬能力,进而调节小鼠巨噬细胞的免疫功能。

鳞柄小奥德蘑凝集素的提取及性质研究

以鳞柄小奥德蘑粉为试材,采用磷酸缓冲溶液浸提凝集素,倍比稀释法测定其热稳定性、耐盐性、糖特异性和对多种血红细胞的凝集能力;以凝血活力为指标,采用单因素试验和正交实验优化了鳞柄小奥德蘑凝集素的提取工艺,以期研究鳞柄小奥德蘑凝集素的最佳提取工艺及其凝血活性。结果表明:鳞柄小奥德蘑凝集素可凝集兔、鸡、羊和人的血红细胞,对兔血红细胞的凝集能力最强,凝集能力无物种专一性和血型专一性;具有一定的耐热性和耐盐性,80℃及以上温度处理可显著降低其凝集能力,且随着处理时间的延长,凝集能力逐渐降低,80℃处理50 min或90℃处理10 min,凝集能力消失;含0~0.8 mol·L-1 NaCl的0.01 mol·L-1磷酸缓冲溶液对其凝集能力无显著性影响;特异性糖为N-乙酰-D-半乳糖胺。鳞柄小奥德蘑凝集素的最佳提取工艺为浸提液种类0.01 mol·L-1磷酸缓冲溶液,料液比1∶15 g·mL-1,浸提时间2 h,浸提液pH 7.0。

热带小奥德蘑深层发酵工艺研究

通过对热带小奥德蘑深层发酵培养基碳源、氮源和无机盐的筛选 ,利用正交试验得到了优化发酵培养基配方 ,在此基础上对发酵条件进行了探索。试验结果表明 ,热带小奥德蘑的适宜发酵培养基为 :葡萄糖 3%,蛋白胨 0 .4 %,KH2 PO40 .1%,MgSO4·7H2 O 0 .2 %,VB10 .0 1%。其适宜发酵温度为 2 8℃ ,起始pH5 .0～ 6.0 ,摇瓶装量 60mL 2 5 0mL ,接种量 10 %。

一株野生热带小奥德蘑菌株的鉴定及出菇试验

为选育适合高温期生产的食用菌品种,对采自雷州半岛高温期发生的野生蘑菇子实体进行组织分离,得到菌株YYY。通过对野生子实体的形态特征和分离菌株YYY的ITS序列分析,鉴定该野生蘑菇为热带小奥德蘑或淡褐奥德蘑[Oudemansiella canarii(Jungh.)]。通过菌种的制备及培养,在28~34℃条件下成功栽培出菌株YYY的子实体,其前二潮菇的生物学效率为76.8%。

鳞柄小奥德蘑发酵产物抑菌活性初步研究

采用抑制菌丝生长速率法、活体组织法及盆栽法对鳞柄小奥德蘑发酵产物的抑菌活性进行了研究。结果表明,鳞柄小奥德蘑发酵产物具有较强的抑菌活性,且抑菌活性成分主要分布于菌丝体提取物中。在供试浓度为0.5 mg/mL(菌丝干重)时,其菌丝体丙酮提取物对苹果腐烂病菌(Cytospora sp.)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata (Fries) Keissler)、苹果炭疽病菌(Golletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.et Sacc.)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis(Nisikado.et Miyake)Shoem.)和番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea Pers.et Tris.)等5种病原真菌菌丝生长抑制率均高于80%;在活体组织法测定中,菌丝体丙酮提取物对番茄灰霉病具有较好的防治效果,3 d的治疗效果和保护效果分别为71.2%和76.2%;在盆栽试验中对玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard&Suggs)和小麦白粉病(Blumeria graminis(DC.)Speer.f.sp.tritici Marchal)的治疗效果和保护效果均在60%以上。

厚褶小奥德蘑栽培及其抗氧化活性

对采自广东省鼎湖山的一株野生小奥德蘑(Oudemansiella sp.)进行分类鉴定与栽培,研究其液体培养菌丝体的水提液、醇提液和发酵液的抗氧化活性。采用形态学特征与rDNA-ITS序列分析相结合的方法,将其鉴定为厚褶小奥德蘑(O.crassifolia)。利用栽培料(58%杂木屑、30%棉籽壳、10%麸皮、2%碳酸钙,含水量65%,pH自然),在(25±1)℃条件下遮光培养20 d,菌丝满袋后再培养15~16 d,转入出菇房,在25~28℃、相对湿度85%~90%条件下,每日300~500 lx光照10 h,菇蕾产生后,每日通风3~4次,出菇3~4潮,生物学转化率达到79.15%。本研究中,厚褶小奥德蘑菌丝体水提液的还原力和对羟自由基的清除能力明显高于菌丝体醇提液和发酵液,与对照维生素C相比,厚褶小奥德蘑菌丝体水提液的还原力低于维生素C,而对羟自由基的清除能力是维生素C的1.81倍。

鳞柄小奥德蘑多糖对体外培养的巨噬细胞抑制结直肠腺癌细胞生长的影响

【目的】研究鳞柄小奥德蘑多糖对体外培养的巨噬细胞抑制结直肠腺癌细胞生长的影响。【方法】建立巨噬细胞和结直肠腺癌细胞的体外共培养体系,采用四甲基偶氮唑蓝法测定存活细胞数量,荧光探针法标记细胞内NO的合成,Griess法检测NO的分泌量,双抗体夹心法测定诱导型一氧化氮合成酶、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1分泌量。【结果】在一定的浓度范围内,鳞柄小奥德蘑多糖对结直肠腺癌细胞生长无显著影响,但能显著降低共培养体系中结直肠腺癌细胞的数量(P<0.05),增加巨噬细胞对诱导型一氧化氮合成酶合成(P<0.05)、NO和肿瘤坏死因子-α的分泌量(P<0.05)。【结论】鳞柄小奥德蘑多糖可能通过提高巨噬细胞对诱导型一氧化氮合成酶、NO和肿瘤坏死因子-α的合成或分泌,从而抑制结直肠腺癌细胞的增殖、增强巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的能力,并降低了共培养体系中结直肠腺癌细胞的数量。