小泛素样修饰物特异性蛋白酶3通过调节脂滴水平体外促进HepG2细胞丙型肝炎病毒复制

目的探究丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞小泛素样修饰物特异性蛋白酶3(SENP3)对脂滴水平的调节及其对HCV复制的影响。方法以感染性HCV病毒颗粒感染人HepG2细胞,采用Western blot法检测感染前后SENP3蛋白表达水平。采用脂质体法转染SENP3-siRNA至HepG2细胞,在感染HCV后采用Western blot法检测HCV核心蛋白表达量,采用qRT-PCR法检测HCV RNA水平,采用油红O染色观察细胞脂滴水平。以软脂酸处理敲低SENP3后的HepG2细胞,采用qRT-PCR法检测感染HCV后HCV RNA水平。结果在HCV感染HepG2细胞后1 d、3 d和6 d,HCV核心蛋白相对表达量分别为0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04,SENP3蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04,差异显著(P<0.05);转染SENP3-siRNA可有效降低SENP3表达并降低HCV感染后细胞HCV核心蛋白表达水平;SENP3敲低细胞HCV RNA相对水平为54.2±11.4%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01);敲低SENP3蛋白表达后细胞脂滴数量显著减少;敲低SENP3的HepG2细胞感染HCV后HCV RNA相对水平为58.2±5.2%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01),而以软脂酸处理敲低SENP3的HepG2细胞,在感染HCV后HCV RNA相对水平为74.6±6.4%,较未经软脂酸处理细胞显著升高(P<0.01)。结论在HCV感染肝细胞时SENP3可通过调节脂滴代谢促进HCV复制。

血管内皮生长因子A与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5在前列腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子A(VEGFA)与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5(SENP5)在前列腺癌中的表达情况及临床意义。方法:使用GEPIA数据库,对VEGFA、SENP5基因的相关性及与前列腺癌病人的生存期进行分析;采用qRT-PCR、Western blotting从转录、蛋白质翻译水平检测肿瘤细胞中VEGFA、SENP5的表达情况;收集前列腺癌病人组织标本和临床资料,采用免疫组织化学法检测前列腺癌组织中VEGFA、SENP5的蛋白表达,分析其表达情况与肿瘤病人临床病理参数间的关系;使用STRING网站进行VEGFA、SENP5蛋白质互作网络图构建。结果:VEGFA与前列腺癌病人总生存时间有关(P<0.05),SENP5与病人总生存时间、无病进展生存时间均相关(P<0.05);与正常细胞相比,VEGFA与SENP5在前列腺癌细胞中mRNA、蛋白质均高表达(P<0.05);VEGFA与SENP5蛋白在肿瘤病理组织中可见淡黄色或棕黄色染色,VEGFA主要于细胞质中表达,SENP5主要于细胞核中表达;VEGFA强阳性表达与临床分期、有无远处转移相关(P<0.05),SENP5强阳性表达与Gleason评分、有无远处转移相关(P<0.05);VEGFA与SENP5间显著相关(P<0.01);SENP5可能通过SUMO1-HSP90AA1轴与VEGFA相互作用。结论:VEGFA、SENP5在前列腺癌中高表达,两者显著相关,且与肿瘤临床病理参数有关,可能是前列腺癌病人治疗的潜在靶点。

泛素特异性蛋白酶21对胆管癌细胞增殖及迁移的影响及机制

目的:探究泛素特异性蛋白酶21(USP21)在胆管癌(CCA)中的表达及其对CCA细胞增殖与迁移的作用及其机制。方法:通过生物信息学方法和免疫组化及WB法检测CCA组织及细胞中USP21的表达情况。利用体外克隆形成、EdU及Transwell实验检测敲低USP21对CCA细胞QBC939和RBE增殖及迁移的影响。通过RNA测序、质谱、免疫共沉淀(Co-IP)及WB法探究USP21的促癌机制。结果:TCGA等数据库分析结果显示,USP21 mRNA在CCA组织中呈高表达(均P<0.05)。USP21蛋白在CCA组织和细胞中呈高表达(P<0.05或P<0.001或P<0.0001)。敲低USP21后,QBC939和RBE细胞的增殖和迁移能力均显著降低(P<0.01或P<0.001)。RNA测序结果表明,敲低USP21可以通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制CCA细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。质谱鉴定发现,USP21与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)相结合。Co-IP和WB实验结果表明,USP21与IGF2BP1结合并通过泛素化途径调控IGF2BP1的蛋白表达(P<0.001或P<0.0001)。结论:USP21在CCA组织和细胞中均呈高表达,其通过IGF2BP1/PI3K/AKT信号通路增强CCA细胞的增殖及迁移能力。

小泛素样修饰物特异性蛋白酶1促进人胆管癌细胞株QBC939的增殖与侵袭

本研究旨在观察小泛素样修饰物特异性蛋白酶1（SENP1）对人胆管癌细胞株QBC939增殖与侵袭能力的影响。

小胶质细胞中小泛素样修饰蛋白特异性蛋白酶3参与小鼠光化学栓塞法缺血性脑卒中早期的疾病进展

目的探讨小泛素样修饰蛋白特异性蛋白酶3(SENP3)在光化学栓塞法缺血性脑卒中小鼠小胶质细胞中的表达变化,以及与光化学法栓塞缺血性脑卒中疾病进展的关系。方法实验小鼠分对照组、缺血性脑卒中1 d组和缺血性脑卒中7 d组(每组3只),应用Western blotting检测各组纹状体诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(ARG-1)和SENP3的表达和c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化水平;应用免疫荧光双标法检测小鼠纹状体小胶质细胞中iNOS和ARG-1的表达。结果与对照组相比,缺血性脑卒中1 d组SENP3的表达与JNK的磷酸化水平均显著上升,同时M1型小胶质细胞的标志物iNOS的表达水平显著上升;缺血性脑卒中7 d组M2型小胶质细胞的标记物ARG-1的表达显著增高。纹状体小胶质细胞特异性抗体1(Iba1)与iNOS、Iba1与ARG-1的免疫荧光双标结果与免疫印迹结果一致。结论光化学栓塞法缺血性脑卒中早期,小胶质细胞SENP3表达增加,进而影响JNK磷酸化的水平和小胶质细胞的极化,促进大脑炎症反应,参与缺血性脑卒中的疾病进展。

小泛素样修饰蛋白特异性蛋白酶SENPs与癌症

类泛素化修饰也称SUMO化修饰,是将小类泛素样修饰蛋白SUMO分子共价连接到靶蛋白上的蛋白质翻译后修饰过程。它参与转录调控、细胞周期调控、信号转导、细胞增殖和凋亡等诸多生命活动过程。在细胞内,也存在将SUMO从靶蛋白上切除下来的逆过程,即去SUMO化;该过程是由SUMO特异性蛋白酶一SENPs通过其异肽酶活性切断靶蛋白与SU-MO分子的异肽连接来完成。正常细胞内蛋白质的SUMO与去SUMO水平维持动态平衡;一旦这种平衡被打破,就能引起疾病甚至癌症的发生。目前已发现多种癌组织中SENPs的表达异常,文章主要就SENPs家族的表达异常对癌症发生发展的影响作一综述。

重组泛素样特异性蛋白酶1在大肠杆菌中的表达条件优化与分离纯化

目的确定重组泛素样特异性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)在大肠杆菌中的最佳表达条件并进行分离纯化。方法采用DNA重组技术,构建重组质粒Ulp1-pET-28a,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导Ulp1原核表达,并从诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度方面确定其最佳表达条件,再以亲和层析法分离纯化Ulp1。结果SDS-PAGE分析表明,工程菌诱导温度为30℃、诱导时间为6 h、IPTG浓度为0.2 mmol/L时Ulp1表达量最高,表达量约为350 mg/L且成功进行了Ulp1的分离纯化。结论本研究成功进行了Ulp1原核表达条件的优化与分离纯化,为Ulp1在生物工程中的酶切应用奠定了实验基础。

小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1对脐静脉内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及凋亡的影响。方法用20个感染复数的p LKO.1-SENP1-小发夹RNA(shRNA)-绿色荧光蛋白(GFP)干涉慢病毒(SENP1干涉组)和p PIG-U6-随机序列(scramble)-GFP对照慢病毒(GFP-SC对照组)感染HUVEC。病毒感染HUVEC 48 h后,用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western蛋白质印迹法检测HUVEC内SENP1基因和蛋白表达水平。用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 GFP-SC对照组和SENP1干涉组感染效率均>97%。与GFP-SC对照组比较,SENP1干涉组HUVEC SENP1基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。CCK8法测定结果表明,SENP1干涉组HUVEC增殖能力较GFP-SC对照组明显降低(P<0.01)。SENP1干涉组细胞迁移过Transwell小室的细胞数量明显低于GFP-SC对照组(P<0.01)。用低浓度血清(含2%胎牛血清)培养基诱导细胞凋亡24 h,SENP1干涉组细胞凋亡率即已升高到GFP-SC对照组的2倍左右(P<0.05);诱导凋亡至48 h,SENP1干涉组细胞凋亡率升高到对照组的3.2倍左右(P<0.05)。结论 HUVEC内SENP1表达水平的降低不仅可以显著抑制细胞增殖和迁移能力,亦可促进细胞凋亡。

可溶性泛素样特异性蛋白酶1的表达及活性鉴定

目的:高效可溶性表达泛素样特异性蛋白酶1(ULP1)。方法:根据大肠杆菌密码子的偏好性优化合成编码ULP1的基因片段序列,将其克隆到原核表达载体p GEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达8 h,观察重组蛋白ULP1的表达情况;优化诱导时间及IPTG浓度,并鉴定重组蛋白ULP1的生物学活性。结果:重组蛋白ULP1表达的最佳条件为37℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导表达5 h,目的蛋白以可溶性表达为主;Western印迹结果表明,重组蛋白ULP1能够被His单克隆抗体识别,重组蛋白ULP1能够特异性酶切SUMO-GFP。结论:表达了具有生物学活性的SUMO蛋白酶ULP1。

小泛素样修饰物蛋白酶3调控小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬

目的探讨小泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)特异性蛋白酶3(SUMO-specific protease 3,SENP3)对小鼠肺组织细胞自噬的调控作用及分子机制。方法应用免疫荧光技术检测SENP3在肺组织细胞中的定位;对SENP3基因野生型C57BL/6J小鼠(SENP3^+/+)和SENP3基因敲除杂合子小鼠(SENP3^+/-)进行饥饿处理,诱导细胞自噬;应用免疫印迹法评估细胞自噬水平;应用电子显微镜观察和免疫荧光技术分析发生自噬的细胞类型;应用免疫共沉淀方法检测自噬相关分子卷曲螺旋状Myosin样Bcl-2相互作用蛋白1(coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein 1,BECN1)的SUMO化修饰。结果 SENP3在肺泡Ⅱ型上皮细胞中高表达。小鼠经饥饿处理后,肺泡Ⅱ型上皮细胞出现自噬现象,且SENP3^+/-小鼠较SENP3^+/+小鼠更明显。同时,肺组织样品中BECN1的SUMO2/3化修饰被SENP3去除。结论 SENP3抑制饥饿应激时小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的自噬,并可对细胞自噬程度进行精细调控。

胰凝乳蛋白酶样蛋白酶体的活性作为前列腺癌生物标志物的潜在应用

目的:探讨胰凝乳蛋白酶样蛋白酶体(chymotrypsin-like proteasome,CLP)活性作为前列腺癌生物标志物的可行性。方法:检测在体和离体的蛋白酶体活性,同时检测核因子κB的抑制蛋白α(inhibitory protein α of nuclear factorκB,IκB-α)、Bcl-2相关X蛋白(BCL-2 associated X protein,Bax)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,p27)的表达。结果:与正常前列腺上皮细胞及对照小鼠前列腺组织相比,前列腺癌细胞和前列腺肿瘤异种移植物中蛋白酶体底物蛋白IκB-α、Bax和p27的表达水平降低,CLP的离体和在体活性分别升高70%和23%。结论:CLP的活性可能是一种潜在的前列腺癌生物标志物,可能适合前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)在前列腺癌诊断中的补充。

小泛素样修饰物修饰与肿瘤相关研究进展

小泛素样修饰物(SUMO)能与目标蛋白产生共价连接,调节靶蛋白的活性,从而改变其在细胞内的功能。SUMO与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。多种癌蛋白、肿瘤抑制子、DNA修复蛋白和周期蛋白都是SUMO的靶蛋白,SUMO系统中的某些酶在肿瘤中的表达也可能发生相应改变。现就与肿瘤相关的SUMO研究进展作一综述。

泛素特异性蛋白酶15稳定着色性干皮病F蛋白并促进DNA链间交联损伤修复

着色性干皮病F蛋白(xeroderma pigmentosum group F,XPF)和切除修复交叉互补组1蛋白(excision repair cross complementing group 1,ERCC1)组成一种结构特异性的核酸内切酶(XPFERCC1)复合物,参与DNA链间交联(interstrand crosslink,ICL)损伤修复。其中,XPF蛋白的去泛素化修饰对DNA损伤修复的影响尚未见报道。本工作主要研究泛素特异性蛋白酶15 (ubiquitinspecific protease 15,USP15)对XPF的稳定性及ICL修复的影响。本研究通过蛋白质质谱和Western印迹法分析发现,XPF蛋白与USP15存在相互作用,进而使XPF蛋白去泛素化修饰;采用CRISPR-Cas9技术构建USP15基因敲除的He La细胞株(USP15 KO)并进行Western印迹分析,结果显示,敲除组XPF蛋白水平低于对照组(P<0. 001)。克隆形成试验显示,在ICL诱导剂顺铂(cisplatin,DDP)和丝裂霉素C (mitomycin,MMC)的作用下,USP15基因敲除的HeLa细胞增殖能力显著降低(P<0. 01)。本研究表明,去泛素化酶USP15是一种重要的DNA修复调节因子,该酶通过稳定XPF蛋白促进由XPF-ERCC1介导的ICL修复。本研究为改善ICL诱导剂类抗癌药物的耐药性提供了理论依据,并为肿瘤的治疗提供了潜在的新靶点。

泛素特异性蛋白酶22与多系统肿瘤的研究进展

泛素特异性蛋白酶22(USP22)为USP家族成员之一,是乙酰转移酶复合体(SAGA)的关键亚基,是B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(BMI1)通路上11个标记基因中的一个。近年来的研究表明,USP22在多种恶性肿瘤中高表达,涉及肿瘤细胞的增殖、转移和药物敏感性。寻找更好的生物标志物来实现肿瘤的诊断及治疗是非常迫切的。本文着重讨论USP22与各系统肿瘤发生发展的关系,为肿瘤的治疗提供新的靶点。

去SUMO化蛋白酶的生物学功能与作用基础研究

小泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰是一种新发现的类泛素蛋白质修饰形式。SUMO修饰由活化酶E1、接合酶E2和连接酶E3等三个酶相继作用来完成。同时它又是一个动态的、可逆的过程,其去SUMO修饰的过程则是由SUMO特异性蛋白酶(SENP)家族来介导。在蛋白质SUMO修饰的动态过程中,SENP介导的去SUMO过程是决定其靶蛋白质SUMO修饰水平的一个主要因素,同时也是SUMOylation被调节的一个主要环节。SENP家族包括SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7等成员,每个成员具有不同的细胞内定位和底物特异性。虽然对其生化特性进行了大量研究,但SENP在参与的细胞生命活动过程中的作用并未十分了解。我们通过分析SENP1和SENP2基因敲除小鼠的表型,发现了SENP1通过正反馈机制调控缺氧-HIF1α和雄激素受体所介导的信号通路,从而在HIF1α与AR所参与的生理病理过程中发挥了重要作用。同时,我们发现SENP2通过调控PcG的活性,参与心脏的发育过程。这些结果表明SENP在调控其靶蛋白所参与的信号通路中发挥了重要作用。

黑色素瘤SENP1蛋白质参与达卡巴嗪耐药性的探究

目的探究与黑色素瘤耐药性相关的基因及信号通路,揭示其与黑色素瘤耐药性的相关性。方法以A375及M14黑色素瘤细胞为研究对象,通过逐渐提高达卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)的浓度获得耐药性黑色素瘤细胞株,采用转录物组学研究耐药性黑色素瘤细胞系中显著性变化的基因及通路,利用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质杂交(Western blotting,WB)等对变化的基因进行验证。结果(1)成功构建了黑色素瘤耐药细胞株:通过DTIC小剂量逐步增加的方法成功建立了耐药型的黑色素瘤细胞系A375与M14,通过计算其对DTIC的半抑制浓度值(the half maximal inhibitory concentration,IC50),确定了细胞对DTIC的敏感性发生了显著的变化;通过流式细胞技术检测,发现耐药的黑色素瘤细胞具有显著抗DTIC引发的凋亡的能力。(2)发现了黑色素瘤耐药性相关的基因及信号通路:利用建立的耐DTIC的黑色素瘤细胞系,进行了全基因组转录测序和分析,发现了类泛素特异性蛋白酶1(SUMO-specific protease 1,SENP1)的高表达和蛋白激酶Hippo信号通路的异常活化相关。(3)SENP1异常表达可能参与DTIC耐药:WB检测野生型和耐药型黑色素瘤细胞系发现在耐药的细胞中,SENP1与YAP表达都上调。(4)通过基因敲除证实SENP1参与DTIC耐药,蛋白质相互作用实验初步证实SENP1对YAP存在去泛素化调控作用。结论SENP1与DTIC耐药性存在正相关关系,其异常上调可能导致Hippo信号通路发生变化使得黑色素瘤对DTIC耐受性的提升。

皮肌炎自身特异性抗体与皮肌炎相关性恶性肿瘤的研究进展

皮肌炎是一种自身免疫性疾病,且常伴发恶性肿瘤。超过50%的皮肌炎患者体内存在肌炎自身特异性抗体。皮肌炎自身特异性抗体[抗迁移抑制因子(migration inhibitory factor,Mi)-2抗体、抗核小体蛋白(nuclear matrix protein,NXP)-2抗体、抗转录中介因子(transcription intermediary factor,TIF)1-γ抗体、抗小泛素样修饰物激活酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme,SAE)抗体]在皮肌炎相关性恶性肿瘤的发病机制中扮演着重要角色。揭示皮肌炎自身特异性抗体在皮肌炎并发恶性肿瘤中的作用,可为准确评估皮肌炎患者发展为恶性肿瘤的风险提供重要依据,也可为临床诊断皮肌炎和精准的个体化治疗提供新思路。

小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白及其特异性蛋白酶的原核表达及鉴定

本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Smallubiq uitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因,通过RecJoin克隆技术分别成功构建SENP和ECFP-SUMO-EYFP表达载体B28和B13。将表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Westernblotting分析鉴定,并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。最终,SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达,SENP5C以包涵体形式表达,其他蛋白均为可溶性表达,SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符,Western blotting方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了SENP1C和SENP2C的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光共振能量转移实验奠定了实验基础。

抗小泛素样修饰物激活酶抗体阳性结缔组织病患者临床特征

目的探究抗小泛素样修饰物激活酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme,SAE)抗体阳性结缔组织病患者的临床特征。方法回顾性选择2015年1月1日—2021年5月30日于四川大学华西医院就诊的完善了肌炎自身抗体筛查的患者,筛选出抗SAE抗体阳性的患者。根据抗SAE抗体阳性患者的临床资料分为以下几组:(1)合并肿瘤组、未合并肿瘤组;(2)合并ILD组、未合并ILD组;(3)炎性肌病组、非炎性肌病组。收集上述患者的临床症状、体征、实验室检查、影像学检查等临床资料。结果共筛选接受肌炎自身抗体检查患者1594例,其中抗SAE抗体阳性56例,阳性率为3.5%。在56例患者中,32.1%皮肤受累、35.7%肌肉受累、12.5%关节受累、5.4%吞咽困难、5.4%体重下降、58.9%合并间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)以及12.5%存在肿瘤病史。合并肿瘤组和未合并肿瘤组在年龄、性别、以及是否有皮肤受累、肌肉受累、关节受累、呼吸系统受累方面进行比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。除年龄、肌肉受累频率、抗Ro-52抗体的阳性率外,其余指标在合并ILD组和未合并ILD组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。除ILD阳性率、皮肤受累频率、肌肉受累频率、肌酸激酶和羟丁酸脱氢酶水平外(P<0.05),其余指标在非炎性肌病组和炎性肌病组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论抗SAE抗体阳性患者主要表现为皮肤及肌肉症状,容易出现ILD、可合并恶性肿瘤、吞咽困难等。抗SAE抗体阳性合并ILD的患者,年龄更高,肌肉损伤更少,抗Ro-52抗体的阳性率更高。抗SAE抗体不仅出现于炎性肌病患者,亦可出现于非炎性肌病患者中,常合并较高频率ILD及较少肌肉累及。

小泛素样修饰通路在常见恶性肿瘤靶向治疗机制中的研究进展

小泛素样修饰(SUMO)是一种动态可逆的翻译后修饰,在体内多个水平上调节着蛋白质功能。研究结果显示一些关键肿瘤因子和肿瘤抑制因子是SUMO底物。在肿瘤的环境中,SUMO通路成员不仅生物活性由于条件的改变(如缺氧)而发生改变外,而且在不同肿瘤中的表达水平也会出现异常。SUMO通路表达失调必将破坏SUMO化与去SUMO化之间的动态平衡,该平衡一旦被打破,将促进各种肿瘤的发生和耐药。现已研究表明许多与特定肿瘤发病机制相关的分子机制都涉及SUMO化修饰,这也突出了SUMO通路作为恶性肿瘤治疗靶点的潜在可能性。本文总结SUMO化修饰通路在常见恶性肿瘤中的靶向治疗及其作用机制的最新研究进展。