核因子-κB信号通路中小泛素样修饰蛋白与2型糖尿病的关系

小泛素样修饰蛋白化是通过一系列小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)酶介导的生化级联反应将SUMO共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上,提高蛋白质稳定性,介导靶分子定位和功能调节的过程。经典通路κB抑制蛋白激酶(inhibitory proteinκB kinaseβ,IKKβ)/核因子κB(nuclear factorsκB,NF-κB)途径是炎性反应的关键信号转导通路。而NF-κB是公认的参与炎症和免疫反应的调节因子。研究发现,不仅NF-κB抑制蛋白(inhibitory protein,IκBa)的SUMO化修饰参与NF-kB信号通路的调节,而且SUMO酶可以直接介导NF-kB对靶基因的转录调控,某些蛋白也可能与SUMO化蛋白有相互作用。文中对SUMO修饰系统、SUMO循环及参与SUMO化循环的酶对NF-kB信号通路的转录调控及其与2型糖尿病相关性研究进行综述。

小泛素样修饰蛋白4基因163A/G多态性与上海地区汉族人群2型糖尿病周围神经病变的相关性分析

目的探讨小泛素样修饰蛋白(SUMO)4基因163A/G多态性与上海地区汉族人群2型糖尿病周围神经病变(DPN)的相关性。方法上海地区197例汉族2型糖尿病患者,其中伴有DPN 108例(DPN组),无DPN 89例(非DPN组)。受试者均进行神经电生理检测,测定神经包括正中运动神经、正中感觉神经、尺运动神经、尺感觉神经、胫神经和腓肠神经。应用传导速度、潜伏期和振幅的Z分综合评估周围神经功能。Z分计算方法:以传导速度为例,传导速度Z分=(正中运动神经传导速度Z分+正中感觉神经传导速度Z分+尺运动神经传导速度Z分+尺感觉神经传导速度Z分+胫神经传导速度Z分+腓肠神经传导速度Z分)/6,其中各神经传导速度Z分=(实测值-正常对照组均数)/正常对照组标准差。应用PCR-限制性片段长度多态性方法检测SUMO4基因163A/G多态性。结果检出多态基因型AA、GA和GG,基因型频率分布符合HardyWeinberg遗传平衡定律。非DPN组AA、GA、GG基因型频率分别为42.7%、44.9%和12.4%,DPN组分别为39.8%、47.2%和13.0%;非DPN组和DPN组A等位基因频率分别为65.2%和63.4%,G等位基因频率分别为34.8%和36.6%,两组间基因型和等位基因频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。不同基因型患者间各神经传导速度、潜伏期、振幅、传导速度Z分、潜伏期Z分、振幅Z分,以及周围神经功能异常率和DPN患病率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。Logistic回归分析结果显示,矫正年龄、性别、糖化血红蛋白和糖尿病病程后,DPN组与非DPN组SUMO4多态基因型和等位基因频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论在上海地区汉族2型糖尿病患者中未发现SUMO4基因163A/G多态性与DPN有关。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

小泛素样修饰物特异性蛋白酶3通过调节脂滴水平体外促进HepG2细胞丙型肝炎病毒复制

目的探究丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞小泛素样修饰物特异性蛋白酶3(SENP3)对脂滴水平的调节及其对HCV复制的影响。方法以感染性HCV病毒颗粒感染人HepG2细胞,采用Western blot法检测感染前后SENP3蛋白表达水平。采用脂质体法转染SENP3-siRNA至HepG2细胞,在感染HCV后采用Western blot法检测HCV核心蛋白表达量,采用qRT-PCR法检测HCV RNA水平,采用油红O染色观察细胞脂滴水平。以软脂酸处理敲低SENP3后的HepG2细胞,采用qRT-PCR法检测感染HCV后HCV RNA水平。结果在HCV感染HepG2细胞后1 d、3 d和6 d,HCV核心蛋白相对表达量分别为0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04,SENP3蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04,差异显著(P<0.05);转染SENP3-siRNA可有效降低SENP3表达并降低HCV感染后细胞HCV核心蛋白表达水平;SENP3敲低细胞HCV RNA相对水平为54.2±11.4%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01);敲低SENP3蛋白表达后细胞脂滴数量显著减少;敲低SENP3的HepG2细胞感染HCV后HCV RNA相对水平为58.2±5.2%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01),而以软脂酸处理敲低SENP3的HepG2细胞,在感染HCV后HCV RNA相对水平为74.6±6.4%,较未经软脂酸处理细胞显著升高(P<0.01)。结论在HCV感染肝细胞时SENP3可通过调节脂滴代谢促进HCV复制。

小泛素样修饰蛋白4基因163 A/G多态性与2型糖尿病肾病的相关性研究

目的探讨小泛素样修饰蛋白4(SUMO4)基因163 A/G多态性与2型糖尿病肾病(DN)的相关性。方法运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对232例T2DM患者,其中正常白蛋白尿103例(N-UAlb组)、微量白蛋白尿65例(M-UAlb组)、大量白蛋白尿64例(I-UAlb组),以及102名健康对照(NC组)的SUMO4基因163 A/G多态性进行检测,并比较各组间基因型频率、等位基因频率及相关临床资料。结果 NC组和T2DM组基因型和等位基因频率无统计学差异;M-UAlb和L-UAlb组的GA基因型频率高于N UAlb组(P<0.05)。结论在昆明地区汉族人群中,SUMO4基因GA基因型可能是DN发生的危险因素。

基于UBA2/PTEN/PI3K/Akt通路探讨蔓荆子黄素对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 基于泛素样修饰激活酶2(UBA2)/磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路探究蔓荆子黄素对结直肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 取对数生长期的SW480细胞,对照组细胞常规培养,蔓荆子黄素组细胞加入10μmol/L蔓荆子黄素培养,UBA2抑制剂组细胞加入0.5μmol/L UBA2抑制剂培养,蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞加入10μmol/L蔓荆子黄素和0.5μmol/L UBA2抑制剂共培养。CCK-8实验检测细胞增殖情况,克隆形成实验观察细胞的单克隆形成能力,划痕实验观察细胞的迁移能力,Transwell实验观察细胞的侵袭能力,Western blot法检测细胞中UBA2/PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白表达情况。结果 CCK-8实验和克隆形成实验显示,UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组培养72 h后的细胞增殖吸光度OD值明显低于蔓荆子黄素组(P均<0.05),细胞克隆形成数量均明显少于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组培养不同时间的细胞增殖吸光度OD值和细胞克隆形成数量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。划痕实验和Transwell实验显示,UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组划痕间距均明显宽于蔓荆子黄素组(P均<0.05),穿膜细胞数量均明显少于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。蔓荆子黄素组、UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞中PTEN蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05),UBA2、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05);UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞中PTEN蛋白相对表达量均明显高于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显低于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组UBA2、PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 蔓荆子黄素可能通过抑制UBA2/PTEN/PI3K/Akt信号通路发挥抗结直肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

鼻咽癌组织中SUMO2、TRIM21表达及临床预后意义

目的研究鼻咽癌(NPC)组织中泛素样小分子修饰因子2(SUMO2)、三结构域蛋白家族成员21(TRIM21)的表达及临床预后意义。方法选取2015年2月至2018年2月期间开滦总医院诊治的96例NPC患者。应用免疫组化检测组织中SUMO2、TRIM21的表达,Spearman秩相关分析NPC中SUMO2与TRIM21表达的相关性。分析SUMO2、TRIM21表达与临床参数的关系。Kaplan-Meier生存分析NPC中SUMO2、TRIM21表达与患者生存预后的关系。单因素及多因Cox回归分析NPC患者预后影响因素。结果NPC癌组织中SUMO2、TRIM21表达阳性率分别为72.92%(70/96)、75.00%(72/96),高于癌旁组织的6.25%(6/96)、7.29%(7/96),差异均有统计学意义(χ2=89.205、90.870,均P<0.05)。NPC癌组织中SUMO2与TRIM21蛋白表达呈明显正相关(r=0.756,P<0.05)。临床分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化程度、有淋巴结转移NPC癌组织中SUMO2、TRIM21表达阳性率高于临床分期Ⅰ~Ⅱ期、高/中分化程度、无淋巴结转移癌组织,差异有统计学意义(均P<0.05)。SUMO2表达阳性及阴性组的5年生存率分别为67.14%(47/70)、88.46%(23/26),SUMO2表达阳性组5年累积生存率低于阴性组,差异有统计学意义(Log-Rankχ2=4.757,P=0.029)。TRIM21表达阳性及阴性组5年生存率分别为66.67%(48/72)、91.67%(22/24),TRIM21表达阳性组5年累积生存率低于阴性组,差异有统计学意义(Log-rankχ2=5.303,P=0.021)。临床分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化程度、淋巴结转移、SUMO2与TRIM21表达阳性是影响NPC预后的独立危险因素。结论NPC中SUMO2、TRIM21蛋白表达上调,与不良临床病理特征有关,是影响NPC患者不良预后的独立危险因素。

UBE2I在KRAS突变型结肠癌中表达及其对KRAS突变型结肠癌细胞增殖的影响

目的观察小泛素样修饰蛋白-E2连接酶(UBE2I)在KRAS突变型结肠癌组织中的表达及其对KRAS突变型结肠癌细胞系增殖能力的影响。方法分析癌症基因组(TCGA)中86例已知KRAS突变类型的结肠癌样本中UBE2I差异表达水平及临床意义。构建短发夹RNA(shRNA)介导的UBE2I基因沉默KRAS突变型结肠癌细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测结肠癌细胞中UBE2I mRNA与蛋白表达,CCK8增殖实验及细胞克隆实验分别检测细胞增殖及克隆能力变化。结果 UBE2I在KRAS突变型癌组织中表达明显上调(P <0.01),且其表达水平与KRAS突变型结肠癌患者临床分期及病理分级密切相关(病理分级P <0.01;临床分期P=0.02)。KRAS突变型结肠癌细胞HCT116、DLD1的UBE2I基因沉默后,克隆形成能力(P <0.01)及72 h后细胞增殖能力(P <0.01)均明显降低。结论 UBE2I在KRAS突变型结肠癌组织及细胞株中表达上调,沉默UBE2I基因可显著抑制肿瘤细胞的增殖及克隆能力。

SUMO4基因163 A/G多态性与2型糖尿病及糖尿病视网膜病变的相关性研究

目的探讨小泛素样修饰蛋白4(SUMO4)基因163A/G多态性与2型糖尿病(T2DM)和糖尿病视网膜病变(DR)的相关性.方法运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,在昆明地区汉族人中对193例2型糖尿病患者(T2DM组)和102例健康对照者(NC组)的SUMO4基因163A/G多态性进行检测,并比较各组间基因型频率和等位基因频率以及相关临床资料.结果 NC组与T2DM组各基因型和等位基因频率无统计学差异;DR组与DR0组各基因型和等位基因频率也无统计学差异.结论在昆明地区汉族人群中,SUMO4基因163A/G多态性可能不是2型糖尿病和糖尿病视网膜病变发生的危险因素.

隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

背景:免疫抑制会导致机体免疫功能受损,加重病情。隔药饼灸能有效调节机体免疫功能,提高机体免疫力,但其调节机制目前仍不清楚。目的:基于转录组学的生物信息学技术对隔药饼灸干预的免疫抑制模型大鼠进行测序,探究隔药饼灸调控免疫的机制。方法:将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组和隔药饼灸组,每组8只,模型组与隔药饼灸组采用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制模型,35 mg/kg,连续3 d,造模结束后空白组与模型组不做干预,隔药饼灸组在大鼠中脘、神阙、关元及足三里穴位进行艾炷与药饼结合的隔药饼灸干预,连续10 d,1次/d,干预结束后次日取材。取各组大鼠外周血进行白细胞数量检测;采用Illumina测序平台进行RNA-seq,筛选差异基因,结合GO与KEGG数据库,对差异基因进行生物信息学相关分析。结果与结论:①与空白组比较,模型组白细胞数量显著减少(P<0.001)。②RNA-seq共筛选出模型组与空白组间差异基因3026个,其中1565个上调、1461个下调,隔药饼灸组与模型组间差异基因535个,其中280个上调、255个下调。③韦恩图分析获得模型组与空白组159个下调基因经隔药饼灸干预后上调,蛋白互作网络分析获得Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2,Mx1,Syk,Hspa1a及Ret等10个核心靶点;④GO与KEGG分析隔药饼灸调节机体的机制有免疫应答途径、病毒相关、血管新生和自身免疫系统等通路。⑤上述结果证实,实验筛选出隔药饼灸干预免疫抑制与Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2及Mx1靶点有明显关联,并且在免疫应答、病毒相关及血管新生等通路中发挥调控作用。

lncRNA SUMO1P3诱导肝癌HepG2细胞对索拉菲尼耐药的分子机制

目的:探讨长链非编码RNA小泛素样修饰蛋白1假基因3(lncRNA SUMO1P3)促进肝细胞癌(HCC)HepG2细胞对索拉菲尼(SR)耐药的分子机制。方法:体外培养HCC细胞HepG2,采用持续接触浓度递增诱导法建立SR耐药细胞HepG2/SR,以HepG2细胞作为对照,qPCR法检测HepG2/SR细胞中SUMO1P3的表达。利用脂质体转染技术,在HepG2/SR细胞中分别转染si-SUMO1P3和si-NC;在HepG2细胞中分别转染pc-SUMO1P3和pc-DNA,后经5μmol/L的SR处理24 h,qPCR法检测转染细胞中SUMO1P3表达水平,CCK-8法、Transwell实验和FCM分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力和凋亡水平,WB法检测细胞中cyclin D1、Bcl2、BAX、MMP-2和MMP-9的表达。结果:成功构建SR耐药细胞HepG2/SR,HepG2/SR细胞中SUMO1P3表达水平显著高于HepG2细胞(P<0.01)。在HepG2/SR细胞敲减SUMO1P3后,与si-NC组比较,si-SUMO1P3组细胞中SUMO1P3的表达与细胞增殖、迁移、侵袭能力及cyclin D1、Bcl2、MMP-2和MMP-9表达均显著降低,细胞凋亡率和BAX的表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。HepG2细胞过表达SUMO1P3后,与pc-DNA组比较,pc-SUMO1P3组细胞的增殖、迁移、侵袭能力及cyclin D1、Bcl2、MMP-2和MMP-9蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率和BAX的表达均降低(P<0.05或P<0.01);与pc-DNA+SR组比较,pc-SUMO1P3+SR组HepG2细胞的增殖、迁移、侵袭能力及cyclin D1、Bcl2、MMP-2和MMP-9蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率和BAX的表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:lncRNA SUMO1P3可通过调控HCC细胞的周期、凋亡等多种信号通路分子诱导细胞对SR的耐药,从而影响HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡与诱导细胞对SR的耐药。

MuRF2、PPAR γ1和Ub重组质粒的构建及鉴定

目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPAR γ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重组质粒并进行鉴定。方法 根据MuRF2、PPAR γ1和Ub的cDNA序列及GV146和GV417载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。XhoI/EcoRI内切酶分别双酶切PPAR γ1目的DNA与GV146载体;NheI/BamHI内切酶分别双酶切MuRF2和Ub目的 DNA与GV417载体。用连接酶连接双酶切后的目的 DNA和载体,导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒。PCR鉴定重组克隆后进行DNA测序。转染HEK 293T细胞后,于荧光显微镜下观察转染效率;免疫共沉淀实验后用Western blot检测蛋白的表达及蛋白质相互作用。结果 以合成的PPAR γ1、Ub、MuRF2的引物分别对PPAR γ1、Ub和MuRF2的菌落进行PCR扩增,产物大小分别为943、451和1 154 bp,与预期结果一致。测序结果与目的基因序列进行比对分析,证实成功构建出PPAR γ1、Ub和MuRF2的重组质粒。在HEK 293T细胞中共转染His-MuRF2、HA-Ub、PPAR γ1重组质粒,荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染。免疫共沉淀试验后用Western blot检测可见PPAR γ1、MuRF2和Ub蛋白的有效表达,且验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。结论成功构建PPAR γ1、MuRF2和Ub的重组质粒,且三种质粒在HEK 293T细胞中有效表达,验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。

皮肌炎自身特异性抗体与皮肌炎相关性恶性肿瘤的研究进展

皮肌炎是一种自身免疫性疾病,且常伴发恶性肿瘤。超过50%的皮肌炎患者体内存在肌炎自身特异性抗体。皮肌炎自身特异性抗体[抗迁移抑制因子(migration inhibitory factor,Mi)-2抗体、抗核小体蛋白(nuclear matrix protein,NXP)-2抗体、抗转录中介因子(transcription intermediary factor,TIF)1-γ抗体、抗小泛素样修饰物激活酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme,SAE)抗体]在皮肌炎相关性恶性肿瘤的发病机制中扮演着重要角色。揭示皮肌炎自身特异性抗体在皮肌炎并发恶性肿瘤中的作用,可为准确评估皮肌炎患者发展为恶性肿瘤的风险提供重要依据,也可为临床诊断皮肌炎和精准的个体化治疗提供新思路。

外伤性脑损伤后神经细胞保护因子表达的变化

外伤性脑损伤(traumatic brain injuries,TBI)是指外力作用于颅骨所致的头皮、颅骨、硬脑膜和脑组织与外界相通,并由此引发脑组织一系列病理生理学改变的疾病。脑组织损伤后导致神经细胞缺血缺氧,脑血管通透性增加并引发一系列炎性细胞分泌增加,在促进炎症发生的同时改变多种细胞保护因子的表达,如低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible-1,HIF-1)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT-1)、小泛素样修饰蛋白-1(small ubiquitin-like modifier,SUMO-1)、CC趋化因子配体2(CC chemokines ligand 2,CCL2)、瞬时受体电位阳离子通道1(transient receptor potential channel 1,TRPC1)等蛋白质的表达产生一系列应激反应来应对缺氧,进而保护神经细胞免受进一步损伤。本文将围绕脑组织损伤后的神经细胞保护因子改变进行综述。