血管内皮生长因子A与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5在前列腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子A(VEGFA)与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5(SENP5)在前列腺癌中的表达情况及临床意义。方法:使用GEPIA数据库,对VEGFA、SENP5基因的相关性及与前列腺癌病人的生存期进行分析;采用qRT-PCR、Western blotting从转录、蛋白质翻译水平检测肿瘤细胞中VEGFA、SENP5的表达情况;收集前列腺癌病人组织标本和临床资料,采用免疫组织化学法检测前列腺癌组织中VEGFA、SENP5的蛋白表达,分析其表达情况与肿瘤病人临床病理参数间的关系;使用STRING网站进行VEGFA、SENP5蛋白质互作网络图构建。结果:VEGFA与前列腺癌病人总生存时间有关(P<0.05),SENP5与病人总生存时间、无病进展生存时间均相关(P<0.05);与正常细胞相比,VEGFA与SENP5在前列腺癌细胞中mRNA、蛋白质均高表达(P<0.05);VEGFA与SENP5蛋白在肿瘤病理组织中可见淡黄色或棕黄色染色,VEGFA主要于细胞质中表达,SENP5主要于细胞核中表达;VEGFA强阳性表达与临床分期、有无远处转移相关(P<0.05),SENP5强阳性表达与Gleason评分、有无远处转移相关(P<0.05);VEGFA与SENP5间显著相关(P<0.01);SENP5可能通过SUMO1-HSP90AA1轴与VEGFA相互作用。结论:VEGFA、SENP5在前列腺癌中高表达,两者显著相关,且与肿瘤临床病理参数有关,可能是前列腺癌病人治疗的潜在靶点。

去泛素化修饰在衰老相关疾病中的研究进展

去泛素化修饰是由去泛素化酶(DUBs)介导的一类重要的蛋白质翻译后修饰,其主要机制是DUBs与泛素化靶蛋白相互作用,切割或去除靶蛋白的泛素链,进而恢复蛋白的表达水平和功能活性。本文系统性地综述了去泛素化修饰在衰老相关疾病中的最新研究进展,涵盖了DUBs的种类、DUBs在细胞衰老中的作用,以及不同机制对衰老相关疾病的调控,并总结了针对DUBs小分子药物开发以及相关机制的研究进展。本文表明,随着机体的衰老,蛋白更新功能减慢、氧化损伤等因素导致泛素化蛋白累积等,进而细胞出现功能障碍。DUBs通过调节衰老细胞的蛋白质稳态、线粒体功能、细胞周期等机制,在衰老相关疾病中发挥重要且复杂的调控作用。

小分子泛素相关修饰物蛋白修饰对于发动蛋白相关蛋白1维持线粒体动力学平衡的影响

线粒体是细胞内能量代谢的中心,对于维持细胞稳态而言,其形态和功能的调控至关重要。小分子泛素相关修饰物蛋白(small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)修饰和发动蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)在细胞调控中扮演着重要角色,尤其与线粒体动力学密切相关。SUMO修饰是一种重要的蛋白质修饰形式,通过将靶蛋白与SUMO相连来调节这些蛋白质的功能。而DRP1是线粒体分裂蛋白,负责调节线粒体的形态和功能。近年来研究发现,SUMO修饰与DRP1之间存在复杂的相互作用网络,对于线粒体的分裂、融合、自噬等起着重要作用。在DRP1的可变结构域中,有8个赖氨酸残基可以在线粒体锚定蛋白连接酶(mitochondrial-anchored protein ligase,MAPL)的作用下完成SUMO修饰。并且不同亚型的SUMO蛋白对于DRP1功能的调节也不同。SUMO1修饰会使DRP1向线粒体富集,促进线粒体的分裂;SUMO2/3修饰会使DRP1向细胞质转移,减少线粒体的分裂。在实际的细胞程序中,不同亚型SUMO的修饰水平往往是由SUMO特异性蛋白酶(SUMO-specific proteases,SENPs)的类型决定。线粒体作为细胞中重要的能量供应细胞器,其动力学的异常往往会导致诸多疾病的发生,例如:心肌缺血再灌注性损伤、阿尔茨海默病、脑血栓、视网膜病变等。本文综述了SUMO修饰与DRP1之间相互作用对于线粒体动力学调控的研究进展,为进一步揭示细胞调控机制和发展相关疾病的治疗策略提供一定的参考。

SUMO蛋白和高亲和PDGFβR肽共修饰的Bak BH3可溶性表达条件优化

目的优化小分子泛素相关修饰物(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)和高亲和血小板衍生生长因子β受体(Platelet-derived growth factorβreceptor,PDGFβ)的短肽Z PDGFβR共修饰BAK蛋白的功能域多肽BH3,即融合蛋白SUMO-Z-BH3的可溶性表达条件。方法在不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度(0.1、0.3、0.6和1 mmol/L IPTG)、不同的诱导温度(16℃、20℃和37℃)以及不同的诱导时间(20 h、16 h和6.5 h)下,对含重组质粒pET28a/SUMO-Z-BH3的大肠杆菌Rosetta进行诱导表达。利用SDS-PAGE技术分析SUMO-Z-BH3的可溶性表达情况。结果在16℃,0.1 mmol/L的IPTG诱导20 h,SUMO-Z-BH3表达约占上清总蛋白的13.0%;在20℃,0.1 mmol/L的IPTG诱导16 h,SUMO-Z-BH3表达约占上清总蛋白的8.5%;在37℃,不同浓度的IPTG诱导后,上清中SUMO-Z-BH3的表达水平无明显差异,且表达量相对较低。结论融合蛋白SUMO-Z-BH3的最佳可溶性表达条件为16℃,0.1 mmol/L的IPTG诱导20 h,为后续的功能研究打下坚实的基础。

丙泊酚通过促进小泛素化相关修饰蛋白1表达增加抑制神经母细胞瘤细胞系钙内流水平变化

目的立足于小泛素化相关修饰蛋白（SUMO）化修饰这一蛋白质翻译后修饰的全新角度，通过研究丙泊酚对细胞蛋白SUMO化修饰和钙内流的变化探讨丙泊酚的全身麻醉机制。方法采用Western印迹法观察丙泊酚对神经母细胞瘤细胞系（SHSYSY）SUM01化水平变化的影响。并通过脂质体转染法将SUMO特异性蛋白酶（SENP）1导入3×Flag—SUMOlSHSY5Y细胞系降低SUM01化水平，以观察丙泊酚对细胞钙内流变化的影响。采用Fluo一3AM钙离子荧光测定法测定细胞内钙离子浓度。结果以50“mol／L丙泊酚分别孵育3×Flag—SUM01一SHSY5Y细胞系0、30、60、120rain，随着处理时间的延长，SUMO化水平升高，且与蛋白结合状态的SUMO增加，游离态SUMO减少。以5、10、25、50ffmol／L丙泊酚孵育细胞60rain，细胞蛋白SUMO化水平随丙泊酚浓度增加而升高。临床浓度丙泊酚（50Ⅱtool／L）引起细胞钙内流呈双向性变化，在加入丙泊酚的最初数分钟，细胞内钙离子迅速增加，约10～15min达到峰值，后逐渐降低，以45～60min为转折点，随后逐渐低于对照组，与细胞内SUMO化水平变化趋势相同。与0umol／L相比，50、37．5、25ffmol／I。丙泊酚作用60min后细胞内钙离子荧光值显著降低（P值均d0．05），细胞内钙离子浓度明显受到抑制。转入野生型SENPl的细胞中丙泊酚（50~mol／L）对其钙内流影响的双向性消失，细胞内钙离子荧光值与溶剂对照组的差异无统计学意义（P〉O．05）；而在表达突变体SENPl和空载体的细胞中，丙泊酚对钙内流的抑制性影响仍然存在，细胞内钙离子荧光值均显著低于溶剂对照组（P值均d0．05）。结论丙泊酚通过诱导3×Flag—SUM01一SHsY5Y细胞系SUMO化水平表达增加抑制细胞钙内流变化，这也许是丙泊酚发挥抑制效应的全身麻醉机制之一。

泛素相关小修饰蛋白-1在大鼠脑发育过程中的差异性表达

目的探讨泛素相关小修饰蛋白(SUMO)-1在Sprague-Dawley(SD)大鼠脑发育过程中的不同表达及其意义。方法采用实时定量聚合酶链反应、Western印迹法分析及免疫组织化学法检测SUMO-1蛋白在大鼠脑发育不同时期的表达。结果胚胎期15 d(E15)、胚胎期18 d(E18)、新生期(P0)、1周龄(P7)、2周龄(P14)、6月龄(P180)大鼠的SUMO-1 mRNA水平分别为26.106 8±0.427 5、25.234 0±1.076 2、23.340 1±0.327 6、22.683 3±0.695 3、20.546 9±1.757 2、16.708 5±2.927 4。与E15大鼠比较,P7、P14、P180大鼠脑组织中SUMO-1 mRNA水平均显著降低(P值均<0.05),P180大鼠的SUMO-1 mRNA水平又显著低于P7、P14大鼠(P值分别<0.05、0.01),P7大鼠与P14大鼠间SUMO-1 mRNA水平的差异无统计学意义(P>0.05)。E15、E18、P0大鼠脑组织中结合状态SUMO-1蛋白的表达量较高,出生后随着生长发育,P7及P14大鼠结合状态SUMO-1蛋白的表达量较E15大鼠降低,P180大鼠结合状态SUMO-1蛋白的表达量较E15大鼠显著降低。E18大鼠小脑组织外颗粒层(EGL)、浦肯野细胞层(PCL)中均有SUMO-1表达;P14大鼠EGL、PCL、内颗粒层(LGL)中均有SUMO-1表达;与E18大鼠比较,P14大鼠PCL中SUMO-1蛋白的含量显著减少(P<0.05)。SUMO-1蛋白在发育早期的海马原基中已有表达,与E18大鼠比较,P14大鼠海马中SUMO-1蛋白的含量显著增多(P<0.05)。E18大鼠含有丰富神经干细胞的室管膜区(VZ)+室管膜下区(SVZ)内的SUMO-1蛋白含量很高,在皮质板区(CP)内也有表达;与E18大鼠比较,P14大鼠VZ+SVZ的SUMO-1蛋白含量显著减少(P<0.05);E18大鼠VZ+SVZ的SUMO-1蛋白含量显著高于同时期脑组织的其他部位(P值均<0.01)。结论在SD大鼠脑发育的不同时期,SUMO-1在空间及数量上的表达均有差异。

肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化

背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化。早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大。目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C蛋白。方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR技术获得SP-C cDNA序列,纯化后的SP-C基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-C cDNA与PET-28a定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C。然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C重组质粒转入BL21中诱导表达。结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA及其重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,在5000～7500bp和250～1000bp处可检测到2条条带。核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597bp,为一开放阅读框架,与GeneBank中公布的人SP-C cDNA序列相符。Western-blot检测结果显示,纯化后的SP-C蛋白在相对分子质量约27000处出现1条新生条带,与预期的大小一致。结果证实,实验成功克隆人SP-C基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C重组质粒,将其体外转化至BL21后可以表达SP-C蛋白。

鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白(Etmic-2)与鸡泛素融合蛋白基因的DNA疫苗表达载体的构建

本文用RT_PCR技术从鸡的肌肉组织中扩增出泛素 (ubiquitin_Ub)编码基因 ,再将其定向克隆到真核表达载体pCMV_Script中多克隆位点的BamHⅠ、HindⅢ之间 ,构建成重组质粒pCMV_Ub。经酶切和测序确定为正确后 ,再将来源于E .teella裂殖子的Etmic_2基因克隆到pCMV_Ub质粒中Ub基因下游的SalⅠ位点上 ,经酶切鉴定 ,获得编码Etimc_2基因的真核表达载体pCMV_Ub_mic_2。该载体中的Etmic_2基因与Ub融合表达 ,并将用于DNA疫苗免疫鸡 ,希望融合了Ub的Etmic_2蛋白能更有效的进入MHC_Ⅰ循环 。

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶 (mDHFR)和绿色荧光蛋白 (GFP)融合基因的重组腺相关病毒 (AAV)载体 ,并使其在NIH3T3细胞中表达 ,观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段 ,并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起 ,插入T载体 ,酶切后插入AAV载体 ,包装成病毒后感染NIH3T3细胞 ,通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察。结果 :PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA ,荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为 2 5 % ,MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强。结论 :AAV载体可以将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达 ,使其对MTX的耐药性增强 。

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。

小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1对脐静脉内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及凋亡的影响。方法用20个感染复数的p LKO.1-SENP1-小发夹RNA(shRNA)-绿色荧光蛋白(GFP)干涉慢病毒(SENP1干涉组)和p PIG-U6-随机序列(scramble)-GFP对照慢病毒(GFP-SC对照组)感染HUVEC。病毒感染HUVEC 48 h后,用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western蛋白质印迹法检测HUVEC内SENP1基因和蛋白表达水平。用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 GFP-SC对照组和SENP1干涉组感染效率均>97%。与GFP-SC对照组比较,SENP1干涉组HUVEC SENP1基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。CCK8法测定结果表明,SENP1干涉组HUVEC增殖能力较GFP-SC对照组明显降低(P<0.01)。SENP1干涉组细胞迁移过Transwell小室的细胞数量明显低于GFP-SC对照组(P<0.01)。用低浓度血清(含2%胎牛血清)培养基诱导细胞凋亡24 h,SENP1干涉组细胞凋亡率即已升高到GFP-SC对照组的2倍左右(P<0.05);诱导凋亡至48 h,SENP1干涉组细胞凋亡率升高到对照组的3.2倍左右(P<0.05)。结论 HUVEC内SENP1表达水平的降低不仅可以显著抑制细胞增殖和迁移能力,亦可促进细胞凋亡。

SUMO和ZPDGFβR共修饰TGF-βⅠ型受体模拟肽的融合蛋白可溶性表达条件优化

目的 优化小分子泛素相关修饰物(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)和血小板衍生生长因子β受体亲和肽(Platelet-derived growth factor β receptor-specific affibody,ZPDGFβR)共修饰的转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)Ⅰ型受体模拟肽(RIPΔ),即SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达条件。方法 将含有重组质粒pET28a/SUMO-Z-RIPΔ的阳性大肠杆菌Rosetta用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiopirran galactoside,IPTG)(终浓度为0.1、0.3、0.6、1 mmol/L),在不同温度和不同时间下(37℃诱导6 h,20℃诱导16 h,16℃诱导20 h)实行诱导,利用SDS-PAGE技术检测SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达情况。结果 当温度为16℃、诱导时间为20 h和IPTG浓度为0.1 mmol/L时,该重组SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达达到最大值,约占上清中总蛋白的16.87%。结论 获得SUMO-Z-RIPΔ高可溶性表达的最优条件,为往后目的蛋白的制备和纯化打下基础。

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。

肿瘤中环状RNA泛素结合相关蛋白2的表达及调控作用研究进展

泛素结合相关蛋白2(UBAP2)是一种新发现的环状RNA,其在诸多人类肿瘤中异常表达并能参与调控肿瘤恶性生物学行为进程如肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、抗凋亡和上皮间质转化等。环状RNA UBAP2(circ-UBAP2)的异常表达也与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期、微血管浸润等病理特征有关;并且circ-UBAP2与环状RNA临床应用的研究热点如调控肿瘤细胞自噬、诱导细胞放疗和化疗耐受等也紧密相关。本文就circ-UBAP2在肿瘤中的表达、生物学作用及调控机制进行综述。

S期激酶相关蛋白2(SKP2)泛素化修饰OGG1对中波紫外线诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤作用

目的探索E3泛素连接酶S期激酶相关蛋白2(SKP2)介导的碱基切除修复蛋白8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶(OGG1)在年龄相关性白内障(ARC)发生过程中的泛素化降解机制。方法采用免疫沉淀实验检测OGG1的泛素化修饰及其与SKP2的结合能力。采用中波紫外线(UVB)照射人晶状体上皮细胞株SRA01/04构建细胞氧化损伤模型。蛋白免疫印迹实验检测细胞氧化损伤模型和过表达模型细胞中SKP2的蛋白表达。通过转染SKP2质粒,增加SKP2的表达并观察细胞中OGG1蛋白的表达变化。结果OGG1蛋白存在泛素化修饰。UbiBrowser软件预测能与OGG1结合的潜在E3泛素连接酶,并通过免疫沉淀实验证明SKP2与OGG1之间存在相互作用。在氧化损伤环境下,SRA01/04细胞中SKP2蛋白表达出现先下降后逐渐升高的趋势,其中UVB照射10 min时SKP2表达下降最为显著。对照组、转染空载质粒组和转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中SKP2蛋白的相对表达量分别为1.040±0.007、0.920±0.008和1.330±0.020,与转染空载质粒组相比,转染SKP2过表达质粒组细胞中SKP2蛋白的表达显著上调(P<0.05)。空白对照组、UVB组、UVB+转染空载质粒组和UVB+转染SKP2过表达质粒组细胞中OGG1蛋白的相对表达量分别为1.05±0.01、5.05±0.16、5.20±0.07和3.83±0.10;与UVB+转染空载质粒组相比,UVB+转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中OGG1蛋白相对表达水平明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论E3泛素连接酶SKP2能够促进OGG1发生泛素化降解,导致晶状体上皮细胞内部损伤性DNA的累积,从而导致ARC的发生发展。

STAT3蛋白真核表达载体的构建及其泛素化功能研究

为研究信号转导与转录激活因子3(STAT3)的活性调控机制,克隆人源STAT3基因,并将其构建在真核表达载体上。之后,通过细胞内共表达STAT3和泛素化质粒的方法,验证了STAT3蛋白可以发生多种类型的泛素化修饰。结果表明,K63位非降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的磷酸化,从而影响STAT3的活性及功能的发挥;而K48位降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的降解,使STAT3蛋白得以更新,这2种类型的泛素化对STAT3蛋白及其功能都十分重要。

肝癌相关抗原HAb18G真核表达载体的构建及表达

目的在真核细胞中高效表达肝癌相关抗原HAb18G。方法构建含有肝癌相关抗原HAb18G基因的真核表达载体 ,并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS 7细胞和CHO细胞 ,并分别进行瞬时及稳定表达 ;通过间接免疫荧光染色和流式细胞仪检测蛋白的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体 pcDNA 3/HAb18G ,并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光染色证实 ,HAb18G高效表达于转染细胞的胞膜上。流式细胞仪分析显示 ,COS 7细胞的转染率约为7.5 % ,平均荧光强度为7.36 ,从CHO细胞获得的单个阳性克隆的平均荧光强度为2.17。结论以上结果为大量获得表达的HAb18G蛋白分子用于其生物学功能的研究奠定了基础。

Heymann肾炎RAP全长及氨基端融合蛋白表达载体的构建及表达

目的构建大鼠Heymann肾炎致病源RAP全长和氨基端多肽原核融合表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用RT-PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,筛选阳性克隆测序;设计针对RAP全长和氨基端的引物进行PCR扩增,获得相应的DNA。纯化后与PGEX-4T-1载体连接,亚克隆到感受态细菌BL21中,经IPTG诱导,表达融合蛋白并纯化,经SDS-PAGE和Western Blot检验。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083/258,并表达出RAP全长70kD和氨基端36kD的融合蛋白。Western Blot结果显示分别在70、36 kD处出现特异性条带,与理论相符。结论RAP1083/258与pGEX-4T-1融合基因表达载体的成功构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为后续研究RAP不同区段在Heymann肾炎发病机制中的作用奠定了基础。

过表达人细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)促进MCF-7乳腺癌细胞生长及S期细胞增加

目的构建带FLAG标签的细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2并检测其对MCF-7乳腺癌细胞生长及细胞周期的影响。方法采用反转录PCR从MDA-MB-231乳腺癌细胞中扩增Skp2基因,构建重组真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至MCF-7乳腺癌细胞中。采用Western blot法检测FLAG-Skp2的表达,Alamar blue比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与Gen Bank结果一致。Western blot结果显示质粒转染48 h后,细胞成功表达融合蛋白FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7乳腺癌细胞较对照组生长速度明显加快,S期细胞显著增多。结论成功构建人Skp2真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7细胞生长加快,S期细胞增多。

建立稳定抑制死亡相关蛋白激酶表达的细胞系

目的筛选稳定抑制DAPK表达的PC12细胞系,并观察这些细胞系的生长特性。方法设计、合成4条RNA干扰序列,连接到pDsRed1-N1-U6质粒载体上,扩增后提取质粒转染到PC12细胞,并同时转染1株空载质粒作为对照,然后通过G418筛选细胞克隆,建立稳定增殖细胞系,再通过Western blot筛选最为有效的干扰序列,最后用MTT、流式细胞术等检测转染细胞系的生长特性。结果4条干扰序列均已成功转染并筛选出单克隆细胞系,Western blot实验结果证实,4条干扰序列中有3条对DAPK的表达有明显的抑制作用,其中以第2条干扰序列的抑制效果最为明显。结论成功建立稳定增殖和抑制DAPK表达的细胞系。