犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。

犬瘟热病毒小熊猫株(LP)的动物感染试验

将从死亡小熊猫肝脏病料中分离到的ＣＤＶＬＰ株第９ 代ＭＤＣＫ 细胞培养毒，按不同剂量各接种７ 只２～３ 月龄的健康幼犬，接种犬全部发病。于接种后７ 天时各捕杀２ 只犬进行检测，电镜检查、ＣＤＶＲＴ－ ＰＣＲ、ＣＤＶ的分离及中和试验结果均为阳性，说明接种犬发生了ＣＤＶ 感染。结合接种犬出现的临床症状及病理解剖学变化结果进行的分析表明，ＣＤＶＬＰ株是一株强毒，并且具有很强的免疫原性。人工感染犬试验结果表明某动物园小熊猫发病及死亡是由ＣＤＶ引起的。

犬瘟热病毒小熊猫株的驯化致弱及其免疫研究

犬瘟热病毒 (CDV)小熊猫低代强毒 (LPV9)经MDCK、CRFK和Vero细胞分别传至 2 1、2 0、2 0代 ,并采用蚀斑技术对传代毒进行克隆。病毒每传 2 0代进行 1次致弱程度鉴定 ,结果表明LPV9随所传代数增加 ,对幼犬的致病性逐渐减弱 ,至第 70代 (LPV70 )时 ,对接种犬失去了致病性。 2个组犬按每只 1× 10 4 TCID50 ,分别接种LPV70 和疫苗弱毒复壮株R 2 0 /8,14d后前者刺激接种幼犬产生的中和抗体效价均大于 1∶10 0的完全保护价 ,而后者则有低于 1∶10 0的 (攻毒保护率分别为 5 /5和 4/5 ) ,故驯化致弱的LPV70 免疫原性要好于疫苗弱毒复壮株R 2 0 /8。将LPV70 分别在细胞上连续 2 0代、在幼犬连续传代 5代后 ,其细胞培养物及从动物体内回收的病毒免疫原性及安全性能够稳定遗传。

犬瘟热病毒小熊猫株反向遗传系统的构建及其鉴定

以驯化致弱的犬瘟热病毒小熊猫株(Canine distemper virus,CDV)为模板,构建犬瘟热病毒感染性cDNA克隆。对其全基因组序列测定后,用RT-PCR的方法获得组成全长基因的7个片段,通过酶切、拼接将7段CDVcDNA序列插入到真核表达载体pCI的MCS上,构建犬瘟热病毒小熊猫株的全长cDNA质粒(pCI-CDV-LP),同时分别克隆CDV小熊猫株N、P、L蛋白ORF构建三个辅助质粒。酶切鉴定和序列测定表明,pCI载体中插入的核酶及CDV cDNA序列正确无误,使用转染试剂Lipofectamine TM2000将全长质粒和三个辅助质粒共转染中国仓鼠肾细胞(BSR),经RT-PCR、间接免疫荧光和病毒感染VERO-SLAM细胞试验鉴定,成功拯救出CDV小熊猫株,显示CDV小熊猫株反向遗传系统构建完成,为犬瘟热病毒致病机理及免疫研究奠定基础。