内蒙古绒山羊PRDM6基因插入/缺失(InDel)检测及其与生长性状的关联分析

PRDM6属于PRDM蛋白家族的一员,PRDM6基因编码1个转录抑制因子,具有与DNA、RNA、蛋白质结合的能力,同时还具有组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶活性。全基因组关联分析结果显示,PRDM6基因遗传变异与骨密度和体质量等性状显著相关,且该基因插入/缺失(Indel)遗传变异还被发现与陕北白绒山羊的多个生长性状显著相关。因此,本研究将PRDM6基因作为研究对象,以期挖掘到与内蒙古绒山羊生长性状相关的关键遗传变异位点。结合Ensembl数据库提供的山羊PRDM6遗传变异信息和已发表文章中的遗传变异位点,本研究探究了2个InDel位点(rs656578433、rs651603667)多态性及其在内蒙古绒山羊群体中的分布规律。发现在本研究检测的群体中,只有第一内含子区的12 bp InDel(rs651603667)存在多态性。不同基因型与生长性状的关联分析结果显示,rs651603667存在3种基因型,即纯合插入型(II)、杂合型(ID)和纯合缺失型(DD),频率分别为0.399、0.444、0.159。在育成羊群体中,此rs651603667突变与体质量、胸深显著相关(P<0.05);在成年羊群体中,rs651603667突变与体长、髋宽显著相关(P<0.05),和体高、胸深极极显著相关(P<0.01);此外,皮尔逊(Pearson)相关分析结果显示,该突变位点显著影响的生长性状均与体质量存在极显著相关(P<0.01)。综上,PRDM6基因12 bp InDel突变位点与内蒙古绒山羊体长、髋宽和体高、胸深具有显著或极显著相关性,可作为内蒙古绒山羊生长性状选育的有效分子标记。

大豆长片段插入/缺失标记的开发与应用

为了开发稳定可靠、操作简便的大豆分子标记,以12份地理来源不同的大豆种质资源为材料,通过基因组10倍深度重测序开发长片段插入/缺失(InDel)标记,并应用2018年黄淮海大豆多点鉴定96份参试品系DNA指纹图谱构建。结果表明,在参试材料中,共检测到插入/缺失片段长度大于20 bp的InDel标记66561个,平均每条染色体InDel标记的数量为3262个;位于内含子的InDel占比12.35%,位于基因上游序列和下游序列的InDel占比分别为25.83%,20.44%,位于基因间隔区的InDel占比34.39%,位于外显子的InDel占比0.19%,位于5′-UTR和3′-UTR的InDel占比分别为0.93%和1.51%;片段长度介于20~40 bp的InDel数量为42453个,41~60 bp为13044个,61~80 bp为5034个,81~100 bp为2285个,大于100 bp为2413个;从检测到的66561个InDel位点中,根据插入/缺失片段长度,在基因组中随机选区160个InDel位点,利用引物设计、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,在55℃的退火温度条件下,开发出32个有且仅有2个等位变异、基于1%琼脂糖凝胶电泳技术易于分辨的长片段插入/缺失标记。应用新开发的32个标记,构建了2018年黄淮海大豆多点鉴定96个参试品系DNA指纹图谱,参试的大豆材料纯度为96.84%,没有同物异名现象发生。研究开发的InDel标记稳定可靠、操作简便,可应用于大豆DNA指纹图谱构建、种子纯度检测等工作。

PLIN1基因InDel位点检测及其与同羊尾脂和生长性状的关联分析

为了探讨同羊PLIN1基因结构及PLIN1基因的插入/缺失(inserted/deletion,InDel)位点对同羊尾脂和体尺性状的影响,试验对PLIN1基因结构进行了生物信息学分析,并测量了166只健康同羊的尾脂和体尺性状;通过测量同羊表型数据、提取基因组DNA,并采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序等方法检测PLIN1基因的InDel位点和分型情况,然后对PLIN1基因的InDel位点与同羊尾脂和体尺性状进行关联分析。结果表明:PLIN1基因位于绵羊的18号染色体上,有8个外显子和7个内含子。绵羊、山羊、普通牛、欧亚野猪、智人、小鼠的PLIN1蛋白结构高度保守,原鸡和绿头鸭的PLIN1蛋白结构与其他物种存在差异,以上8个物种的PLIN1蛋白有10个共同基序,2个特定的保守结构域,PLIN1基因在物种进化中相对保守。同羊的PLIN1基因存在1个26 bp(CGATCCTCGGTGCCCCAGAAACATTC)的InDel位点,包含DD、II和ID 3种基因型,I和D等位基因频率分别为0.2018和0.7982,II、ID和DD基因型频率分别为0.0663,0.2711,0.6627,该位点处于中间多态性(0.250.05);该位点对公羊的体尺性状无显著影响(P>0.05);但该位点的II基因型母羊背高显著高于ID和DD基因型(P<0.05)。说明PLIN1基因的InDel位点可被作为母羊育种的有用分子标记。

GHR基因9-bp InDel与陕北白绒山羊体重和生长性状的关联研究

生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)是生长激素(GH)的特定跨膜受体,对动物正常的生长发育具有重要作用。该试验随机选择532只陕北白绒山羊,通过降落PCR (Touch down PCR)方法鉴定陕北白绒山羊GHR基因第一内含子存在的9bp插入缺失(InDel)情况并分析其与体重、生长性状的相关性。研究发现,陕北白绒山羊GHR基因共出现II、ID、DD 3种基因型;相关分析结果表明,在体重、髋宽、体高、荐高和胸深指标上,基因型ID或DD个体相比较II型个体更具显著性优势(P<0.05),说明该位点等位基因D更有利于山羊的生长发育。研究表明GHR基因可作为陕北白绒山羊体重和生长性状的候选基因,为陕北白绒山羊产业快速高效发展提供科学理论依据。

GDF9基因12-bp InDel与陕北白绒山羊生长性状关联研究

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)也称FecG基因,是影响家畜繁殖力的常染色体主效候选基因,此基因在性腺轴相关组织及内脏组织器官中均有表达,且shRNA下调GDF9基因的表达可能对动物生长轴的调控造成影响,因此,推测GDF9基因对动物正常的生长发育也具有重要作用。为探讨GDF9基因作为山羊生长性状候选基因的可能性,寻找与山羊生长性状相关的分子标记,本研究以陕北白绒山羊(n=638)为研究对象,并结合已有报道利用DNA池检测GDF9基因的InDel位点,评估InDel位点与生长性状的相关性。本研究发现,在638只陕北白绒山羊GDF9基因3′调控区存在12-bp的插入缺失(InDel),群体共出现3种基因型(II,ID,DD),其中I和D等位基因频率分别为0.461和0.539,优势基因型为杂合型(ID)频率为0.874。关联性分析结果表明,该突变位点与陕北白绒山羊体高显著相关(P<0.01),同时显著影响十字部高性状(P<0.05)。其他性状虽然没有显著的相关性,但是其体重、体长等重要生长性状也表现相同的趋势。因此,GDF9基因可作为陕北白绒山羊生长性状选育的候选基因,为陕北白绒山羊选育工作提供理论依据。

鲢InDel-RFLP标记开发及其在连锁图谱构建中的应用

基于随机测序的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)基因组片段,尝试开发基于InDel的限制性片段长度多态性标记(InDel-RFLP)。结果显示:共133个片段中,65个在一个野生鲢群体(该野生鲢群体采自长江流域荆州段,31个个体)中表现多态性。共检测到163个等位基因,每位点等位基因数从2到4不等,平均2.5个。65个多态性标记中,有35个被添加到鲢SSR-AFLP性别平均连锁图谱上。长约2 kb的片段比长约1 kb的片段更适用于InDel-RFLP标记开发。设计特异引物,扩增基因组片段,用4种限制性内切酶(BsuR I、Hha I、Taq I和Vsp I)之一切成适宜聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的小片段,电泳分离、银染分型。该标记系统避免了对InDel精确定位的困难,通过高分辨PAGE分型,可为鲢连锁图谱构建和性状定位提供丰富的标记位点。

绒山羊MARCH1基因InDel位点与体尺性状的关联研究

探究膜相关RING-CH型蛋白1(membrane-associated Ring-CH Protein 1,MARCH1)基因多态能否显著影响内蒙古白绒山羊的生长性状。通过现代分子遗传学技术检测460只内蒙古白绒山羊MARCH1基因启动子区7-bp位点InDel(insertion/deletion)多态性,并利用SPSS 23.0分析软件探究它们与生长性状的相关性。育成羊MARCH1基因启动子7-bp(NC_030813:g.1858696insTAATACG)突变位点DD基因型个体体高均值显著大于ID和II基因型个体(P=0.010),ID基因型个体体长均值显著大于II基因型个体(P=0.036);成年羊该突变位点ID基因型个体管围均值显著大于II基因型个体(P=0.040)。皮尔逊相关分析显示:内蒙古白绒山羊体高、体长和管围与体重性状均存在极显著相关(P<0.01)。MARCH1基因启动子区7-bp位点可作为内蒙古白绒山羊体尺性状的有效分子标记。

基于全基因组重测序技术分析甜菜InDel标记

为了给甜菜种质资源的基因定位及分子标记辅助育种提供数据支撑,对‘MA3001’、‘KWS1231’、‘ZT000589’、‘ZT000549’、‘ZT000286’五个甜菜品种进行了InDel标记的全基因组重测序,将其分别与参考基因组比对,经处理后得到42.84 GB的无重复有效数据。从5个甜菜品种中平均发现了314134.8个InDel位点,其中插入、缺失位点平均分别为158921.4、155212.4个;InDel位点分布在基因间区的数量最多,约占全部位点的55%,在基因区内大部分分布在内含子中;不同甜菜品种全基因组中InDel位点的长度分布趋势基本一致;InDel位点数量随着InDel长度的增加而减少(基因区除外),基因间区内大部分InDel位点的长度为1 bp,约占40%,基因区内大部分InDel位点的长度为3 bp或其整数倍。在蛋白质编码区平均发现了4782个InDel位点,这些InDel位点几乎都会引起编码蛋白质的显著变化;约有1500个InDel位点导致了删除或插入,约有600~800个InDel位点导致了碱基移位,低于100个InDel位点导致了终止密码子的产生和缺失。基因间区以及内含子区域中大于3 bp的InDel位点适合进行InDel引物开发,这些InDel位点的开发将为进行遗传效应分析并鉴定甜菜种质资源提供重要基础。

山羊FN1基因InDel位点鉴定及其与生长性状的关联性分析

【目的】转录组候选基因纤维连接蛋白1(Fibronectin 1,FN1)对于骨分化、骨形成和骨细胞迁移起关键作用。对FN1基因预测突变位点进行DNA池检测,并与山羊生长性状进行关联分析,以期为山羊的遗传育种和性状改良提供分子标记。【方法】利用DNA池检测和PCR-RFLP技术,分析福清山羊、努比亚黑山羊和简阳大耳羊中FN1基因的7个预测突变位点的遗传多态性,并与其生长性状进行关联分析。【结果】通过DNA池检测和PCRRFLP发现,7个预测位点中只有Del66652位点存在多态性,且在3个山羊群体中都只存在Ⅱ和ID基因型,都不处于哈迪温伯格平衡(P>0.05),多态性信息含量小于0.25。关联分析发现,努比亚黑山羊ID基因型个体的管围显著优于Ⅱ基因型(P<0.05),ID基因型的胸围指数极显著优于Ⅱ基因型(P<0.01)。简阳大耳羊ID基因型个体的胸围指数和管围指数显著优于Ⅱ基因型(P<0.05)。【结论】Del66652位点与努比亚山羊和简阳大耳羊的生长性状显著相关,且ID基因型为优势基因型。Del66652位点可作为影响山羊生长性状的分子标记位点,为提高山羊生长性状的品种改良提供研究基础。

基于重测序的南方高蛋白大豆品种福豆234的遗传变异

【目的】揭示南方高蛋白大豆遗传变异提供理论参考。【方法】通过高通量测序技术对南方高蛋白大豆品种福豆234进行全基因组重测序。【结果】共获得64 757 037条Clean reads,测序深度为17×,基因组覆盖度分别达98.08%(1×)和96.25%(5×)。共鉴定出1 478 393个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位点和356 739个小片段插入缺失(Small insertion-deletion, Small InDel)位点。其中共鉴定出14 323个非同义SNP突变的基因,4 186个Small Indel的突变基因位于编码区(Coding sequence, CDS)。通过COG(Clusters of orthologous groups of proteins)分析发现信号传导机制、转录、碳水化合物转输和代谢等和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析发现碳代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸生物合成、植物激素信号传导、内质网蛋白质加工等通路与福豆234遗传变异相关。此外,本研究以大豆籽粒蛋白质含量数量性状基因座(Quantitative trait locus, QTL)的两个主要区段内的候选基因进行分析,发现有65个基因发生SNP或Small InDel水平的变异,其中,SNP变异类型达10种,Small InDel变异类型达7种。【结论】本研究初步揭示南方高蛋白大豆的遗传变异规律,为高蛋白大豆品种选育和分子标记的开发提供数据支持和理论依据。

基于重测序的大豆新品种齐黄34的全基因组变异挖掘

为全面揭示大豆优良品种和重要亲本的全基因组突变类型,采用高通量重测序技术,对大豆品种齐黄34进行全基因组重测序,测序深度13×,共检测到1 519 494个单核苷酸多态位点,357 549个小片段插入缺失位点,4 506个结构变异;这些变异共导致了17 748基因变异;大量光周期相关的重要基因发生突变,其中包括CRYPTOCHROME 2、GIGANTEA、Timing of CAB expression 1、E1、PHYTOCHROME A、Flowering Locus T、CONSTANS、Terminal Flower like等,齐黄34为E1基因型。本研究为分子标记辅助选择提供了重要的标记资源。

鸡催乳素基因序列多态及生物信息学分析

选择繁殖性能具有明显差异的4 个鸡品种(莱航鸡、阳山鸡、丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡)构建品种 DNA池,采用测序的方法快速筛查鸡催乳素基因(chicken prolactin,cPRL)5′侧翼调控区、外显子区和部分内含子区约4500 bp范围内可能与产蛋性能相关的序列多态,共检测到13个SNPs和两个短片段(24 bp和15 bp)插入/缺失多态,其中在5′侧翼序列筛查到9个SNPs及两个短片段插入/缺失多态,在第2外显子筛查到1个SNP,在第5 外显子筛查到两个SNPs,在第2内含子筛查到1个SNP;进一步利用生物信息学分析cPRL 基因的5′侧翼调控序列,发现24 bp短片段的插入使莱航鸡比阳山鸡多出了1个Evi 1可能的结合位点(93分),C 2402T的变异则使阳山鸡比莱航鸡多出了1个C/EBPbeta可能的结合位点(94分),这两个结合位点是否影响 cPRL 基因的表达,影响鸡的就巢性和产蛋性能,还需要进一步研究。

视神经脊髓炎外显子组学的初步研究

目的通过外显子组学测序筛查视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)的基因突变位点,为进一步确定NMO的易感基因积累资料。方法收集散发性NMO患者4例,取其外周血后提取DNA,基于IlluminaHiSeq平台进行全外显子高通量测序,旨在发现患者中共有的基因突变位点。结果 4例患者中共存在33个共有突变位点,其中9个单核苷酸突变和24个小片段插入缺失突变,涉及29个基因。结论 4例NMO患者中共发现33个共有突变位点,涉及29个基因。

分子信标熔解曲线法分析SLC11A1基因插入/缺失多态性

目的针对溶质转运蛋白家族11成员1蛋白(SLC11A1)基因插入/缺失多态性位点rs17235416,建立基于荧光定量PCR(q PCR)的分子信标熔解曲线法对其进行基因分型。方法针对该位点设计特异性的引物和分子信标探针,联合应用非对称q PCR、分子信标探针和熔解曲线分析等技术建立分子信标熔解曲线法进行基因分型。对210份全血样本提取DNA后,用上述方法和改进的PCR-RFLP法对该位点进行检测和分型,并以测序法验证。结果 210份样本的基因型TGTG+/+、TGTG-/-和TGTG+/-分布频率分别为69.5%、4.8%和25.7%。分子信标熔解曲线法和PCR-RFLP法的分型结果与测序结果完全一致。结论国内外首次成功建立分子信标熔解曲线法检测SLC11A1基因rs17235416位点;该方法在大人群样本检测中具有简便、快速、准确等优点。

韩国赤芝全基因组重测序分析

目的:探索韩国赤芝与中国赤芝CGMCC5.0026间在基因组水平上存在的差异,为赤芝的遗传育种提供研究基础。方法:采用高通量重测序技术,对韩国赤芝进行全基因组重测序,并对单核苷酸多态位点突变(SNP)、小片段插入缺失变异(InDel)、结构变异(SV)进行检测和注释。对DNA水平变异基因进行KEGG、GO、COG、NR、SwissProt数据库注释。结果:韩国赤芝重测序覆盖深度为44×,与中国赤芝CGMCC5.0026相比,共发现10607个基因发生非同义SNP,4774个InDel和1428个SV,共导致9469个基因发生变异。这些变异基因中有转录因子86个,细胞色素P450 195个。结论:本研究通过对中国赤芝和韩国赤芝基因组序列进行比较,为赤芝的分子标记育种和对完善灵芝模式真菌研究体系提供了基础。

内蒙古绒山羊KAP9.2基因遗传多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】探究内蒙古绒山羊KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2(KAP9.2)基因插入/缺失(insertion/deletion,InDel)突变及其与生长性状的关系,以期为内蒙古绒山羊分子育种提供理论基础。【方法】选取606只雌性阿拉善型内蒙古绒山羊为研究对象,采集耳组织提取DNA并测定其体重及体高、体长和胸围等体尺数据,利用琼脂糖凝胶电泳方法与直接测序技术检测KAP 9.2基因的InDel突变,检测遗传多样性指标,利用SPSS 23.0软件分析突变位点与生长性状的关联性。【结果】在内蒙古绒山羊KAP9.2基因外显子区存在30 bp的InDel突变,产生II、ID和DD 3种基因型。多态信息含量(PIC)显示,该位点在育成羊群体中属于中度多态(0.25<PIC<0.50),在成年羊群体中属于低度多态(PIC<0.25),且均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05);在整个群体中,属于低度多态(PIC<0.25),但偏离哈代-温伯格平衡状态(P<0.05)。关联分析结果表明,在育成羊群体中,此30 bp的InDel突变对体长和十字部高有显著影响(P<0.05),对体高、胸深和胸宽有极显著影响(P<0.01);在成年羊群体中,此突变对管围、胸深和胸宽有极显著影响(P<0.01)。进一步的分析发现,在育成羊和成年羊全部群体中,此突变对体长和十字部高有显著影响(P<0.05),对体高、胸深和胸宽有极显著影响(P<0.01)。【结论】KAP9.2基因InDel突变对阿拉善型内蒙古绒山羊多个生长性状有显著或极显著影响,可作为内蒙古绒山羊优良性状选育的分子标记。

全基因组重测序分析4个毛竹变型的秆形和秆色变异

为揭示毛竹重要变型的全基因组突变类型,选取4个有代表性的毛竹变型,采用高通量重测序技术,进行全基因组重测序,测序深度12×。分别提取毛竹4个变型与参考基因组间发生非同义突变的SNP、CDS区发生InDel与SV的基因,比较可以发现,2个秆形变异的竹种圣音竹和厚壁毛竹基因组的变异基因数目和变异类型相近,而2个秆色变异的竹种黄槽毛竹和黄皮花毛竹基因组的变异数目和变异类型相近。4个毛竹变型均存在多个基因同时存在多种类型突变。将变异基因与GO、COG、KEGG等功能数据库进行比对、注释,共获得1739个参与细胞壁、细胞膜合成的基因,501个细胞骨架构建相关基因,1785个转录因子相关基因,1324个信号转导相关基因,104个赤霉素相关基因,76个激素代谢相关基因,1938个叶绿素合成相关的基因,73个类胡萝卜素合成代谢相关基因和68个花青素合成调控基因,这些差异基因分别在毛竹秆形和秆色调控方面起着重要作用。

云南黑山羊全基因组重测序

采用Illumina Hiseq2000测序技术对由云南黑山羊具有代表性的个体构建的DNA池进行20X全基因组重测序,以期对云南黑山羊分子特征做出评价,并为云南黑山羊功能基因定位提供分子基础数据。结果表明:云南黑山羊可以检测到7 615 774个SNP、877 232个INDEL和40 005个SV。通过比对山羊参考基因组,并进行生物信息学分析,结果显示云南黑山羊位于外显子区域的SNP有35 902个,其中异义突变17 160个,同义突变18 920个;外显子区域的小INDEL有1 330个;位于内含子区域的SNP 1 695 420个,小INDEL 208 999,位于UTR3区域的SNP 16 106个,小INDEL 580个。研究结果基本阐明了云南黑山羊的分子特征,为后续功能基因的研究提供了强大的数据支撑,并为功能基因的定位提供新的思路和线索。

利用Samtools挖掘山羊生产繁殖相关Indels标记

随着研究的深入,从最初认为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是导致遗传和表型多样性的主要原因,逐渐意识到插入/缺失(insertion/deletion,Indel)的普遍存在,并且与山羊生产繁殖性状密切相关。随着山羊参考基因组序列的公布及测序成本的降低,为大规模开发山羊Indels标记提供了可能。本研究就12个山羊个体(大足黑山羊,DBG,n=6;内蒙古绒山羊,IMCG,n=6)全基因组重测序结果,利用Samtools筛选群体间的差异In-dels。结果表明,12个山羊个体获得192.747GB基因组数据,平均每个个体检测到高质量的Indels位点为334 151个;比较基因组获得2个群体特有的Indels分别为110和100个,注释基因38和30个。其中大足黑山群体特有su-fu、sycp2位点和内蒙古绒山羊群体特有kdm4c位点可能是山羊生长繁殖相关候选Indel标记,为进一步精细解析山羊生产繁殖性状遗传机理奠定基础。

竹亚科叶绿体DNA条形码筛选

竹亚科是一个形态上鉴定困难且易于混淆的类群。DNA条形码技术为这一类群的鉴定提供了一个辅助手段。核心条形码(rbcL+matK)在竹亚科中的鉴别率很低,因此,有必要针对竹亚科筛选有效的DNA条形码片段。本研究根据已发表的竹亚科叶绿体基因组序列,筛选出16个片段,包括1个基因片段和15个基因间隔区,选取青篱竹族和箣竹族的10属22种30个个体,进行引物通用性、测序成功率和变异位点分析。研究结果表明:(1)引物具有较高的扩增成功率,但部分片段中由于存在poly结构造成测序失败;(2)片段中的插入/缺失可以编码,作为信息位点;(3)trnG-trnT(t)具有最多变异位点,建议可作为竹亚科优先选择的DNA条形码;(4)在开展不同类群的DNA条形码和分子系统学研究时,可以按照"trnG-trnT(t)+X"的方式选择合适的叶绿体DNA片段。