消痰化瘀利窍方对慢性间歇性低氧小鼠胸主动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨消痰化瘀利窍方(Xiaotan Huayu Liqiao Formula,XHLF)改善慢性间歇性低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH)小鼠胸主动脉内皮细胞的损伤作用机制。方法:将24只健康的8周龄雄性C57BL/6N小鼠随机分成常氧组(Con组)、慢性间歇性低氧暴露组(CIH组)、慢性间歇性低氧+消痰化瘀利窍方组(CIH+XHLF组)、常氧+消痰化瘀利窍方组(Con+XHLF组)。CIH组与CIH+XHLF组暴露于间歇性低氧的环境中,CIH+XHLF组和Con+XHLF组每日给予消痰化瘀利窍方灌胃(26.8 g/kg/d),而CIH组与Con组给予同等体积生理盐水,共计处理28 d。采用尾套法监测小鼠血压;HE和Masson染色观察胸主动脉病理改变;检测血清中一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)含量;透射电镜观察线粒体形态;Tunel染色观察胸主动脉细胞凋亡情况;免疫组织化学染色检测Cleaved Caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白表达。结果:与Con组相比,CIH组小鼠血压出现升高(P<0.05);血管内膜不平整,细胞核排列紊乱,弹性纤维减少;血清中VEGF水平升高,NO水平下降(P<0.05);线粒体皱缩、嵴断裂;凋亡水平增加,Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱(P<0.05)。与CIH组相比,CIH+XHLF组小鼠血压下降(P<0.05),血管内皮功能和损伤改善(P<0.05),血管内皮线粒体损伤改善,凋亡水平下降(P<0.05)。结论:XHLF可能通过抑制凋亡改善CIH暴露引起的胸主动脉血管损伤和功能障碍。

鱼藤酮激活AMPK-ULK1信号通路诱导大鼠胸主动脉内皮细胞自噬

目的探讨鱼藤酮对大鼠胸主动脉内皮细胞(RTAEC)自噬的影响及其初步机制。方法选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照(Con)组、二甲基亚砜(DMSO)组和鱼藤酮组[1、2、4 mg·(kg·d)^(-1)],各组分别干预28 d。实验前后分别记录大鼠体质量、血压和心率;HE染色观察胸主动脉和心脏组织病理生理改变,透射电镜观察其超微结构及自噬小体发生。细胞实验分组:Con组、DMSO组和鱼藤酮组(20、100和500 nmol·L^(-1)),分别处理24 h,用活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平筛选鱼藤酮干预最佳浓度后,选取500 nmol·L^(-1)进行后续干预。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC)在鱼藤酮处理前2 h干预细胞;RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉自噬相关因子及腺苷酸激活的蛋白激酶-UNC-51样激酶1(AMPK-ULK1)通路的改变。结果与DMSO组相比,鱼藤酮组体质量增长量减少(P均<0.01);鱼藤酮对大鼠的血压和心率没有影响(P均>0.05);HE结果显示,鱼藤酮组胸主动脉内皮细胞伴有缺损,且心脏组织纤维排列紊乱、断裂;透射电镜结果发现,鱼藤酮组胸主动脉和心脏组织伴有结构异常及自噬小体出现;随着RTAEC鱼藤酮干预浓度增大,ROS产生水平增加(P<0.01),而ATP的生成减少(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与DMSO组相比,LC3和P62的mRNA表达水平均上调(P均<0.01);信号通路相关因子AMPK和ULK1的mRNA表达水平均增加(P均<0.01);加入AMPK抑制剂CC,Western blot检测自噬相关蛋白,与500 nmol·L^(-1)组相比,LC3表达降低(P<0.01),P62表达上调(P<0.01);AMPK和p-AMPK表达减少(P均<0.01),AMPK的下游因子ULK1及p-ULK1表达均减少(P均<0.01)。结论鱼藤酮可促进RTAEC发生自噬,而其自噬机制可能是通过AMPK-ULK1信号通路介导。

尾部悬吊大鼠胸主动脉及肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶mRNA表达的动态变化

目的观察模拟失重时大小循环动脉血管内皮细胞一氧化氮合酶mRNA(NOSmRNA)表达随时间变化的过程 ,为模拟失重时血管局部调节的适应机理研究提供资料。方法采用Wistar大鼠 30°尾部悬吊模拟失重效应 ,原位杂交技术观察悬吊 7d(TS7组 )、1 4d(TS1 4组 )及对照 (CON组 )胸主动脉、肺动脉内皮细胞eNOSmRNA和iNOSmRNA表达变化。结果TS7组胸主动脉和肺动脉内皮细胞eNOSmRNA和iN OSmRNA的升高非常显著 ;TS1 4组肺动脉内皮细胞eNOSmRNA的升高仍非常显著而胸主动脉回到对照水平 ,TS1 4组胸主动脉内皮细胞iNOSmRNA回到对照水平而肺动脉下降非常显著。结论模拟失重对大循环动脉内皮细胞eNOSmRNA和iNOSmRNA的影响趋势相似 ,而对肺循环动脉影响趋势不同 ,归因于模拟失重初期由下体转移而来的体液进入大小循环高峰期的时间过程不同 ,可能是模拟失重时局部调节功能降低的一种重要表现 。

大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养和纯化鉴定

目的探索分离、培养大鼠胸主动脉血管内皮细胞的有效方法。方法取Wistar大鼠1只,无菌条件下打开胸腔取出胸主动脉,去除外周结缔组织及脂肪,使主动脉内膜翻出,用丝线结扎动脉两端后用烧热的镊子烫烙。置于50ml铺有鼠尾胶培养瓶中培养,加入含有20%新生牛血清的DMEM/F12培养液静止培养,6d后换液并弃主动脉。经0.125%胰酶差速消化传代,采用免疫细胞化学法鉴定血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子在细胞中的表达情况。结果培养6d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长;12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶底,约70%的细胞汇合成单层;经胰酶差速消化传代细胞生长旺盛,细胞汇合后呈现典型的"鹅卵石"样内皮细胞特征;内皮细胞标志物Ⅷ因子表达阳性率达100%。结论本研究采用的方法简便易行,不需要胶原酶及内皮细胞生长补充物,更为经济适用,适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。

胰高血糖素样肽-1对高糖诱导的兔胸主动脉内皮细胞凋亡与增殖的影响

目的探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对高糖下兔胸主动脉内皮细胞凋亡与增殖变化的影响。方法取兔胸主动脉,用酶消化法分离内皮细胞,传代后于不同实验条件下培养,用TUNEL法测定各组胸主动脉内皮细胞凋亡,用MTT法与BRDU法测定各组胸主动脉内皮细胞的活力与增殖。结果与对照组相比,高糖作用下兔胸主动脉凋亡明显增多,而内皮细胞的活力下降、增殖减少(P<0.01),而用GLP-1预处理后,高糖抑制胸主动脉内皮细胞增殖与活力以及促进凋亡的作用明显减弱(P<0.05,与高糖组相比)。GLP-1的作用可以为GLP-1的受体抑制剂(exendin 9-39)所抵消,与高糖组相比,exendin9-39组的胸主动脉内皮细胞凋亡与细胞活力、增殖无明显变化(P>0.05)。结论胰高血糖素样肽GLP-1对高糖损害血管内皮细胞具有保护作用,其机制可能与其通过GLP-1受体途径促其增殖与抑制凋亡有关。

简易高效分离培养大鼠胸主动脉血管内皮细胞方法的建立

目的建立一种高效分离、培养大鼠胸主动脉血管内皮细胞的方法。方法用Wistar大鼠(200～250 g),无菌条件下开胸取胸主动脉,去除血管外膜,制备长约1.0～1.5 mm动脉环。将血管环垂直置于干燥的培养皿中,并向血管环内加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液、静止培养;24 h血管环贴壁后,加入培养液;3～4 d内皮细胞长出,弃血管环,并经0.25%胰蛋白酶消化传代。用形态学、免疫细胞化学及流式细胞分析等方法,鉴定血管内皮细胞标志物,vWF的表达。结果培养3～4 d时有细胞自主动脉环内迁移出并贴壁生长,细胞汇合后呈现典型的"铺路石"样内皮细胞特征;免疫组化和流式细胞分析结果示,vWF表达阳性率可高达98.3%±0.2%。结论用改良的植块培养方法,不需要胶原及内皮细胞生长补充物,较传统酶消化法更为经济、高效,且简便易行,适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。

胰岛素对牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子受体表达的影响及其与一氧化氮合酶活性的关系

目的 评价胰岛素对培养的牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF)受体flt 1、flk 1 KDR表达的影响及其与一氧化氮合酶 (NOS)的关系。方法 取新生的小牛胸主动脉 ,作血管内皮细胞原代及传代培养 ,取 4 6代培养细胞用于实验 ;应用不同浓度 ( 30mU L、30 0mU L、30 0 0mU L)的胰岛素和NOS抑制剂 (L NAME)干预培养过程 ,4 8h后取培养细胞 ,应用免疫组化法测定flt 1、flk 1 KDR和NOS3的表达水平。结果 不同浓度胰岛素孵育组后内皮细胞flt 1、flk 1 KDR的表达水平差异无显著性 ,L NAME孵育后各组内皮细胞flt 1、flk 1 KDR的表达水平较单纯胰岛素孵育组差异无显著性。结论 胰岛素对内皮细胞flt 1、flk 1 KDR的表达无直接影响 ;内皮细胞NOS3的活性不是内皮细胞VEGF受体flt 1、flk 1

机械刮取法体外培养牛胸主动脉内皮细胞

目的:探讨牛胸主动脉内皮细胞(CTAECs)的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法:无菌手术刀片在牛胸主动脉内膜刮取内皮细胞,"力度梯度标记法"探索刮取力度,细胞收集于含20%南美胎牛血清的培养基中培养,对培养细胞进行Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定。结果:机械刮取法体外培养可以获得大量CTAECs,在倒置显微镜下呈多角形或短梭形,细胞核清晰,呈卵圆形,单层细胞融合后呈铺路石子样排列。细胞生长状态良好,抗Ⅷ因子相关抗原染色呈阳性。结论:机械刮取法是获得CTAECs的一种可取方法,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

TRPV4对高血压小鼠胸主动脉内皮细胞钙离子稳态的调节作用

目的:探讨瞬时受体电位香草素亚型4(transient receptor potential vanilloid type 4,TRPV4)在高血压小鼠胸主动脉内皮细胞中对于钙离子稳态的调节作用。方法:通过高盐饮食诱导小鼠高血压模型,分别在细胞和组织水平上使用钙离子荧光探针Flou-4/AM标记胸主动脉内皮细胞内钙,测定在TRPV4特异性激动剂GSK1016790A刺激下高盐饮食组和普通饮食组中细胞的钙离子浓度变化。结果:在胸主动脉内皮细胞的细胞和组织水平上通过使用GSK1016790A特异性激活TRPV4通道,普通饮食组和高盐饮食组细胞内钙离子浓度均增高(P<0.05),但和普通饮食组相比较,高盐饮食组在GSK1016790A刺激下钙离子荧光强度增幅低于普通饮食组(P<0.05)。结论:TRPV4参与了小鼠胸主动脉内皮细胞钙稳态的调节,通过激活TRPV4,促进内皮细胞外钙离子内流进入胞内,从而维持细胞内钙离子的稳态,而在病理模型,高盐饮食诱导的高血压状态下,TRPV4调节小鼠胸主动脉内皮细胞钙内流的作用受损。

糖基化终产物和高糖对小牛主动脉血管细胞的损伤作用

目的研究糖基化终产物(AGEs)和高浓度葡萄糖对血管细胞的损伤及对其糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响。方法分别用10 g/L糖基化终产物1、0 mol/L葡萄糖和两者的混合作用于牛主动脉血管细胞,利用生化方法测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)、还原型谷胱甘肽(GSH)和NO2-/NO3-的含量,用MTT法测定细胞的活性。用CELL-ELISA和RT-PCR检测细胞RAGE的表达。结果与正常组(C)相比,高糖组(G)、AGEs组(A)和联合损伤组(G+A)对主动脉内皮细胞的生长有明显的抑制作用(P<0.01)和对平滑肌细胞的生长有明显的促进作用,主动脉血管细胞LDH的泄漏量明显增高,GSH和NO2-/NO3-的含量明显减少(P<0.01);且在联合损伤组的作用最强。同时,联合损伤组血管细胞的RAGE表达水平明显高于AGEs组和高糖组。结论AGEs比高浓度葡萄糖更具损伤血管细胞的作用,且AGEs与高糖联合作用对细胞的损伤最为明显,这种联合损伤的过程也是通过RAGE介导的。

细胞色素2J3基因转染减轻大鼠胸主动脉球囊损伤后血管狭窄程度的初步机制

目的:探讨细胞色素2J3(CYP2J3)基因转染减轻动脉球囊损伤后血管狭窄程度的初步机制。方法:36只实验大鼠,其中18只用于建立胸主动脉球囊损伤模型,余18只进行假手术。前者分为三组(n均=6),分别从尾静脉注入生理盐水,为动脉损伤模型组(I组)、CYP2J3(2J3I组)、pcDNA3.1(3.1I组);后者亦分为三组(n均=6),亦从尾静脉注入与上相同试剂,分别为假手术组(Sh组)、2J3Sh组和3.1Sh组。术后28天取各组大鼠胸主动脉,观察动脉环相对管腔面积(RLA)变化,检测细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)蛋白表达。结果:动脉损伤各组大鼠RLA均小于相应Sh组(P<0.05或P<0.01);2J3I组RLA大于I组及3.1I组(P<0.01)。动脉损伤各组较相应Sh组磷酸化ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),2J3I组ERK1/2蛋白表达高于I组和3.1I组(P均<0.01)。动脉损伤各组eNOS蛋白表达低于相应Sh组(P<0.01);2J3I组eNOS蛋白表达高于I组和3.1I组(P均<0.01)。结论:CYP2J3基因转染可减轻动脉损伤后狭窄,其作用与其增加ERK1/2及eNOS蛋白表达有关。

2型糖尿病大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、活性氧簇表达观察

目的观察2型糖尿病(T2DM)大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、活性氧簇(ROS)表达情况。方法随机选取40只大鼠,予高脂饲料喂养,8周后采用尾静脉注射STZ(30mg/kg)诱导方法制备T2DM模型;将最终造模成功的34只大鼠按体质量、血糖分层随机分为辛伐他汀组、模型组各17只。另选取20只大鼠作为正常对照组,给予标准饲料喂养。根据人鼠等效剂量,辛伐他汀组每日以1. 05mg/(kg·d)辛伐他汀溶液灌胃1次,模型组和正常对照组每日以等量无菌饮用水灌胃1次,灌胃16周,后处死取大鼠胸主动脉。电镜下观察胸主动脉内皮细胞病理变化;实时荧光定量PCR方法检测胸主动脉内皮细胞细胞凋亡活化因子-1(Apaf-1)、细胞凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2、Bax mRNA,酶联免疫吸附法检测ROS。结果电镜下可见,正常对照组内皮细胞细胞核清晰,形态完整,有条索样连接紧密、连续;模型组内皮细胞可见明显细胞核固缩、线粒体肿胀,及内皮细胞碎片;辛伐他汀组较模型组病理损伤较轻,内皮细胞相对连续,完整,有轻度肿胀。PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达升高,Bcl-2 mRNA表达降低(P均<0. 05);与模型组比较,辛伐他汀组模型组Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达降低,Bcl-2 mRNA表达升高(P均<0. 05)。结论 T2DM大鼠辛伐他汀灌胃治疗后,可明显减轻内皮细胞核固缩,线粒体肿胀,机制可能为下调Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达,上调Bcl-2 mRNA表达。

白细胞介素-2引起离体大鼠主动脉环舒张及其作用机制

本文旨在研究白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )对离体大鼠胸主动脉环收缩张力的作用及其可能机制。采用累积加药法 ,检测IL 2对去氧肾上腺素 (PE)和KCl预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果表明 ,IL 2 (1、10、10 0、10 0 0U/ml)对PE (10 μmol/L)预收缩的内皮完整血管环产生浓度依赖性的舒张作用 ,而对KCl(12 0mmol/L)预收缩的血管无作用。去除内皮后 ,IL 2的舒张作用被取消。用一氧化氮合酶抑制剂L NAME (0 1mmol/L)和鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝 (10 μmol/L)预处理 ,均可阻断IL 2的舒张血管作用。用环氧合酶抑制剂吲哚美辛 (Indo,10 μmol/L)预处理可阻断IL 2的血管舒张作用。从上述观察结果推论 ,IL 2通过NO

黔产吴茱萸水煎剂对家兔离体胸主动脉作用及机制的研究

目的研究黔产吴茱萸水煎剂对家兔离体胸主动脉平滑肌的作用及其机制。方法采用离体血管环灌流方法,观察吴茱萸水煎剂累积浓度对家兔离体胸主动脉平滑肌张力的影响,并探讨用α受体阻断剂酚妥拉明、钾离子通道阻断剂四乙胺、四氨基吡啶孵育离体胸主动脉后,吴茱萸水煎剂对去除内皮及内皮完整的家兔胸主动脉环张力的影响。结果①吴茱萸水煎剂可使家兔离体胸主动脉环张力呈浓度依赖性增加,且内皮完整的胸主动脉环收缩作用明显强于去内皮组。②酚妥拉明阻断离体胸主动脉平滑肌α受体后,吴茱萸水煎剂不再使去内皮及内皮完整的胸主动脉环张力增加。③四氨基吡啶与吴苵萸收缩家兔离体胸主动脉平滑肌的作用无关,四乙胺对吴茱萸水煎剂的缩血管具有协同作用。结论吴茱萸水煎剂对家兔离体胸主动脉的收缩作用是内皮依赖性的,其机制与α受体有关。

胰岛素对离体大鼠胸主动脉血管张力的影响

制备离体大鼠胸主动脉环,分有内皮组和去内皮组,采用离体血管灌流技术,观察胰岛素对去氧肾上腺素(PE)和氯化钾(KCl)预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果表明胰岛素对PE预收缩的胸主动脉环产生浓度依赖性的舒张作用,且有内皮组和去内皮组间无显著差异。胰岛素对KCl预收缩的胸主动脉环没有显著影响。胰岛素对PE预收缩的胸主动脉环有非内皮依赖性舒张作用。

血凝酶对大鼠离体胸主动脉环收缩作用的影响

目的:研究血凝酶(Reptilase,RTA)对离体大鼠胸主动脉的收缩作用与机制。方法:制备离体大鼠胸主动脉环,经生物信号采集与分析系统测定血管环的张力变化。分有内皮组和去内皮组,采用累计加药法,观察血凝酶对去氧肾上腺素(PE)和氯化钾(KCl)预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果:血凝酶对PE预收缩的胸主动脉环产生浓度依赖性的收缩作用,对内皮完整PE预收缩血管环组显著高于去内皮组;而对KCl预收缩的胸主动脉环张力无显著影响;在内皮完整的血管,预孵内皮素转化酶抑制剂磷阿米酮(phosphoramidone,5×10-6mmol/L,PAMD)后,血凝酶对PE预收缩张力明显低于未孵育组(P<0.01);在去内皮的血管环上,应用EDTA(3mmol/L)螯合细胞外Ca2+或LaCl3(100μmol/L)后,可明显阻断血凝酶对PE预收缩作用(P<0.01)。结论:血凝酶对PE预收缩的胸主动脉环的收缩作用呈浓度依赖性,其机制可能为有内皮细胞途径参与,促进内皮素释放,对PE缩血管产生协同效应;还可能与血管平滑肌上有受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium chan-nel,ROCC)[1]参与,增加血管平滑肌钙内流有关。

熊胆对离体大鼠胸主动脉的舒张作用

用大鼠胸主动脉制备成保存内皮细胞和去除内皮细胞两种血管条标本,以 Tyrode 液灌流。两种血管条在10^(-7)mol/L NE 或50 mmol/L 高钾作用下显著收缩,5～10 min 后依次加入0.01、0.1、0.25、0.5 mg/ml 的熊胆,每次给药间隔10min。观察到两种标本均显示相似幅度的舒张,这种作用随熊胆浓度的增加而增加。0.5 mg/ml 的熊胆可以完全对抗10^(-7)mol/LNE 所致的收缩,而使高钾所致的收缩张力下降50%左右。熊胆对两种血管条的舒张作用无显著差异(P>0.1)。并证明熊胆对血管的舒张作用不依赖于血管内皮细胞。

黄芪苷Ⅳ对微囊泡损伤的大鼠胸主动脉环舒张功能的保护作用

目的:以缺氧/复氧诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)释放的微囊泡(H/R-EMVs)处理大鼠胸主动脉环,造成其舒张功能损伤,探究黄芪苷Ⅳ(AST)对大鼠胸主动脉环舒张功能的影响及相关机制。方法:采用缺氧12h/复氧4 h的方法诱导体外培养的HUVECs产生MVs,H/R-EMVs保存于D-Hank’s液中备用。雄性Wistar大鼠开胸取出胸主动脉,制备3~4 mm宽、内皮完整的胸主动脉环。实验分为6组:H/R-EMVs组,在孵育胸主动脉环的培养基中加入H/R-EMVs,使其终浓度为10μg/ml;不同剂量AST组分别采用10、20、40、60 mg/L AST与10μg/ml H/R-EMVs共同孵育胸主动脉环;对照组给予等体积的D-Hank’s溶液。孵育时间为4 h,每组各测定5个血管环。观察AST对舒张功能的影响,检测一氧化氮(NO)含量及t-eNOS、p-eNOS、t-Akt、p-Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白质水平。结果:H/R-EMVs对大鼠胸主动脉环舒张功能有明显的抑制作用(P<0.01)。与H/R-EMVs组相比,AST20、40和60 mg/L组剂量依赖性地提高大鼠胸主动脉环的舒张率(P<0.01),使NO含量增加(P<0.05,P<0.01);t-eNOS、t-Akt和ERK1/2蛋白质水平不变,p-eNOS、p-Akt和p-ERK1/2蛋白质水平增高(P<0.01)。结论:AST可显著改善H/R-EMVs损伤的大鼠胸主动脉环的舒张功能,其机制与提高NO含量及增加p-eNOS、p-Akt和pERK1/2蛋白质水平有关。