小泛素样修饰物特异性蛋白酶3通过调节脂滴水平体外促进HepG2细胞丙型肝炎病毒复制

目的探究丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞小泛素样修饰物特异性蛋白酶3(SENP3)对脂滴水平的调节及其对HCV复制的影响。方法以感染性HCV病毒颗粒感染人HepG2细胞,采用Western blot法检测感染前后SENP3蛋白表达水平。采用脂质体法转染SENP3-siRNA至HepG2细胞,在感染HCV后采用Western blot法检测HCV核心蛋白表达量,采用qRT-PCR法检测HCV RNA水平,采用油红O染色观察细胞脂滴水平。以软脂酸处理敲低SENP3后的HepG2细胞,采用qRT-PCR法检测感染HCV后HCV RNA水平。结果在HCV感染HepG2细胞后1 d、3 d和6 d,HCV核心蛋白相对表达量分别为0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04,SENP3蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04,差异显著(P<0.05);转染SENP3-siRNA可有效降低SENP3表达并降低HCV感染后细胞HCV核心蛋白表达水平;SENP3敲低细胞HCV RNA相对水平为54.2±11.4%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01);敲低SENP3蛋白表达后细胞脂滴数量显著减少;敲低SENP3的HepG2细胞感染HCV后HCV RNA相对水平为58.2±5.2%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01),而以软脂酸处理敲低SENP3的HepG2细胞,在感染HCV后HCV RNA相对水平为74.6±6.4%,较未经软脂酸处理细胞显著升高(P<0.01)。结论在HCV感染肝细胞时SENP3可通过调节脂滴代谢促进HCV复制。

血管内皮生长因子A与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5在前列腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子A(VEGFA)与小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5(SENP5)在前列腺癌中的表达情况及临床意义。方法:使用GEPIA数据库,对VEGFA、SENP5基因的相关性及与前列腺癌病人的生存期进行分析;采用qRT-PCR、Western blotting从转录、蛋白质翻译水平检测肿瘤细胞中VEGFA、SENP5的表达情况;收集前列腺癌病人组织标本和临床资料,采用免疫组织化学法检测前列腺癌组织中VEGFA、SENP5的蛋白表达,分析其表达情况与肿瘤病人临床病理参数间的关系;使用STRING网站进行VEGFA、SENP5蛋白质互作网络图构建。结果:VEGFA与前列腺癌病人总生存时间有关(P<0.05),SENP5与病人总生存时间、无病进展生存时间均相关(P<0.05);与正常细胞相比,VEGFA与SENP5在前列腺癌细胞中mRNA、蛋白质均高表达(P<0.05);VEGFA与SENP5蛋白在肿瘤病理组织中可见淡黄色或棕黄色染色,VEGFA主要于细胞质中表达,SENP5主要于细胞核中表达;VEGFA强阳性表达与临床分期、有无远处转移相关(P<0.05),SENP5强阳性表达与Gleason评分、有无远处转移相关(P<0.05);VEGFA与SENP5间显著相关(P<0.01);SENP5可能通过SUMO1-HSP90AA1轴与VEGFA相互作用。结论:VEGFA、SENP5在前列腺癌中高表达,两者显著相关,且与肿瘤临床病理参数有关,可能是前列腺癌病人治疗的潜在靶点。

SENP1、SENP5、SENP6蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达及意义

目的探讨小泛素相关修饰物特异性蛋白酶1(SENP1)、小泛素相关修饰物特异性蛋白酶5(SENP5)、小泛素相关修饰物特异性蛋白酶6(SENP6)蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达及其临床意义。方法选择子宫内膜腺癌病例80例、不典型增生62例、增殖期子宫内膜58例。应用免疫组化法检测各组子宫内膜组织中SENP1、SENP5、SENP6表达情况,并分析其与临床病理特征的相关性。结果子宫内膜腺癌组子宫内膜组织中SENP1、SENP5、SENP6阳性率显著高于不典型增生组、增殖期子宫内膜组;不典型增生组子宫内膜组织中SENP1、SENP5、SENP6蛋白阳性率显著高于增殖期子宫内膜组(P<0.05)。SENP1、SENP5、SENP6蛋白的表达均与子宫内膜腺癌的临床分期、组织学分级、浸润及淋巴结转移相关(P<0.05),与患者年龄和病灶大小无关。子宫内膜腺癌组织中SENP1蛋白表达与SENP5、SENP6蛋白表达呈正相关(r=0.708,P=0.000;r=0.773,P=0.000),SENP5蛋白表达与SENP6蛋白表达呈正相关(r=0.632,P=0.000)。结论子宫内膜腺癌组织中存在SENP1、SENP5、SENP6异常高表达,三者表达呈正相关,SENP1、SENP5、SENP6可能在子宫内膜腺癌发生、发展中起到重要的作用。

冠心康冻干粉通过SENP1/STAT3增强小鼠骨髓源巨噬细胞胞葬作用

目的 探索冠心康对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的骨髓源巨噬细胞的小分子类泛素修饰物特异性蛋白酶1(small ubiquitin-related modifiers/sentrispecific proteases 1,SENP1)/信号传导蛋白和转录激活物(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)分子表达及胞葬作用的影响。方法 提取小鼠骨髓来源的单核细胞,加巨噬细胞集落刺激因子,诱导成巨噬细胞,显微镜下观察F4/80荧光标记;加入ox-LDL诱导,不同剂量的冠心康(1.25μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L)作用后,中性红试剂盒检测细胞吞噬率,实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)、免疫印迹法(Western blotting)检测胞葬相关分子TAM酪氨酸激酶受体(TYRO3/AXL/MER receptor tyrosine kinase)、血小板反应蛋白-1 (thrombospondin 1,THBS1)、乳脂球表皮生长因子8 (milk fat globule-epidermal growth factor,MFGE8)表达及SENP1/STAT3分子蛋白表达。结果 (1)骨髓源巨噬细胞的纯度约为99%;(2)与对照组比较,ox-LDL诱导的骨髓源巨噬细胞组细胞吞噬率显著降低(P <0.05);与模型组比较,冠心康显著上调细胞吞噬率(P <0.05);(3)与对照组比较,ox-LDL诱导的骨髓源巨噬细胞组胞葬相关分子、SENP1、p-STAT3表达降低(P <0.05);与模型组比较,冠心康显著上调这些分子的表达(P <0.05)。结论 冠心康通过上调SENP1/STAT3分子表达,增强骨髓源巨噬细胞的胞葬作用。

SENP1参与慢性间歇低氧小胶质细胞极化及神经元损伤机制的研究进展

慢性间歇低氧(CIH)诱导的中枢神经系统(CNS)炎症反应是阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)神经认知功能障碍最重要的病理机制之一。小胶质细胞是维持CNS内环境稳定最重要的免疫反应细胞,不同的极化状态对神经元细胞产生损害或保护作用,准确调控小胶质细胞极化状态是控制炎症反应的关键,有助于维持神经认知功能正常。小类泛素相关修饰物(SUMO)修饰广泛参与机体蛋白翻译后修饰,SUMO特异性蛋白酶1是一种关键的去SUMO化蛋白酶,两者可能参与小胶质细胞极化状态、CNS炎症反应及神经元损伤或凋亡的调控。因此,深入了解CIH小胶质细胞极化及炎症反应机制,能为防治OSAHS神经认知功能障碍提供新思路。

Senp2调控c-Myc对胶质瘤侵袭性影响的机制

目的探讨Senp2基因与c-Myc基因在不同等级胶质瘤中的表达情况,并进一步探讨Senp2基因对于胶质瘤侵袭性的影响。方法运用real-time PCR、蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)等检测不同等级胶质瘤患者病理组织及正常脑组织中Senp2、c-Myc的表达;运用细胞培养和转染技术沉默U87恶性胶质瘤细胞系中Senp2基因的表达,观察细胞中c-Myc的表达情况。通过Transwell侵袭实验、流式细胞术、CCK8法等观察Senp2基因沉默后胶质瘤细胞侵袭性变化情况。结果胶质瘤级别越高的患者c-Myc基因表达水平越高,Senp2基因表达水平越低(P<0.05)。沉默Senp2基因后可见c-Myc基因表达水平明显升高(P<0.05)。通过Transwell侵袭实验,发现沉默Senp2基因的胶质瘤细胞侵袭性强于对照组。同时当沉默Senp2基因后,细胞处于S期的比例明显增加,CCK8法检测发现沉默Senp2基因后胶质瘤细胞的增殖能力明显增强(P<0.05)。结论 Senp2基因与c-Myc基因在不同等级胶质瘤中表达存在差异,胶质瘤等级越高的患者Senp2基因表达水平越低,而c-Myc基因表达水平越高。Senp2基因可影响胶质瘤细胞中c-Myc基因的表达,从而影响胶质瘤细胞的侵袭性。

过表达SENP2对雌激素作用下HeLa细胞增殖与迁移的影响

目的探讨过表达类泛素修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)特异性蛋白酶2(SUMO-specific protease 2, SENP2)蛋白对雌激素作用下的HeLa细胞增殖、迁移的影响和机制。方法 HeLa细胞采用不同浓度雌二醇(estradiol, E2)作用24 h,采用Western blot法检测SUMO1、SENP2蛋白相对表达量,并选取SUMO1、SENP2相对表达量最高的E2浓度用于后续实验。将HeLa细胞分为对照组、E2组、Myc-SENP2组和Myc-SENP2+E2组,其中对照组细胞正常培养;E2组细胞加入E2,终浓度为10-6 mol/L;Myc-SENP2组和Myc-SENP2+E2组细胞采用Myc-SENP2转染,转染后Myc-SENP2组细胞正常培养,Myc-SENP2+E2组细胞加入E2,终浓度为10-6 mol/L。4组细胞培养24 h后采用Western blot法检测SUMO1蛋白相对表达量,采用EdU细胞增殖实验检测EdU阳性细胞率,采用细胞划痕实验检测细胞迁移距离。48只去胸腺小鼠随机分为4组,每组12只,分别接种对照组、E2组、Myc-SENP2组和Myc-SENP2+E2组细胞,比较各组小鼠皮下肿瘤体积和肿瘤质量。结果 E2组细胞SUMO1蛋白相对表达量(0.79±0.10)、EdU阳性细胞率[(62.39±3.03)%]、细胞迁移距离[(83.20±2.94)μm]大于对照组[0.38±0.26、(37.76±3.49)%、(49.07±3.71)μm]、Myc-SENP2组[0.33±0.13、(25.95±2.39)%、(28.36±1.98)μm]和Myc-SENP2+E2组[0.45±0.07、(32.68±2.43)%、(52.64±2.38)μm](P<0.05),对照组和Myc-SENP2+E2组大于Myc-SENP2组(P<0.05),对照组与Myc-SENP2+E2组比较差异无统计学意义(P>0.05);E2组小鼠肿瘤体积[(105.50±8.70)mm3]和肿瘤质量[(0.13±0.02)g]大于对照组[(66.72±7.94)mm3、(0.07±0.01)g]、Myc-SENP2组[(47.85±7.09)mm3、(0.05±0.01)g]和Myc-SENP2+E2组[(72.53±8.63)mm3、(0.07±0.03)g](P<0.05),对照组和Myc-SENP2+E2组大于Myc-SENP2组(P<0.05),对照组与Myc-SENP2+E2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达SENP2能诱导HeLa细胞的蛋白质去SUMO化,抑制E2作用下的细胞增殖和迁移。

新型重组Ulp1的制备工艺研究

类泛素特异性蛋白酶1(Ulp1)是从融合蛋白中移除小分子泛素相关修饰物蛋白(SUMO)标签工艺中的重要工具蛋白酶,在重组多肽和蛋白生产制备中具有广泛应用。Ulp1蛋白易聚集的特性给下游分离纯化工艺带来了诸多挑战。为克服这些问题,本研究设计并重组表达制备了一种S13-Ulp1融合蛋白,以提高Ulp1酶的溶解度,减少聚集,同时降低蛋白等电点,便于采用阴离子交换色谱纯化。通过对发酵、澄清等步骤的工艺参数进行优化,建立了一条发酵表达产量高、纯化工艺简便的S13-Ulp1融合蛋白制备工艺。优化后发酵产量达到了2.34g/L,下游分离纯化总收率为64%,制得的S13-Ulp1蛋白的SDS-PAGE纯度为95%。经酶切试验验证,S13-Ulp1融合蛋白具有与Ulp1相同的特异性,可高效地移除SUMO标签,获得目的多肽。