小粒野生稻内生细菌的分离鉴定和促生功能分析

小粒野生稻(Oryza minuta)是具有良好生物和非生物胁迫抗性的野生稻资源,挖掘小粒野生稻促生相关内生细菌可为其微生态研究和菌肥开发提供参考信息。本研究对小粒野生稻的根、茎和叶进行内生细菌分离,共获得85个菌株。通过促生功能分析发现,43株内生细菌具有溶磷能力,19株具有固氮作用,29株产铁载体,13株产吲哚乙酸。分离自根部的OMR2-3菌株和叶部的OML3-4菌株具有较高吲哚乙酸分泌能力,分别为17.22 mg/L和16.59 mg/L。形态学和分子鉴定显示,OMR2-3菌株和OML3-4菌株分别为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)。通过温室促生效果测定发现,2个菌株对多年生稻粳型品种PR23和籼型品种云大107具有显著促生效果,可以不同程度促进多年生稻幼苗的株高、根长、鲜质量、叶绿素和氮素含量。以上结果说明,小粒野生稻蕴含丰富的促生相关内生细菌资源,从中筛选到的内生阴沟肠杆菌OMR2-3菌株和路德维希肠杆菌OML3-4菌株具有开发成为多年生稻生物微生物菌肥的潜力,有助于多年生稻绿色轻简化的生产模式。

小粒野生稻抗白叶枯病新基因的鉴定与初步定位

【目的】将小粒野生稻(Acc.No.101133)的抗白叶枯病基因导入栽培稻IR24,并对其进行鉴定和分子标记定位,以便应用于育种实践。【方法】以小粒野生稻和栽培稻IR24的BC2F2群体及其F3、F4家系为材料,利用分离集团分析法(BSA),借助SSR标记对Xa35(t)进行分子标记定位。【结果】通过对抗病基因进行抗谱鉴定和遗传分析,结果表明,该基因对白叶枯病菌株PXO86和PXO99表现感病,而对PXO61、PXO112和PXO339表现抗病,初步将其定位于水稻的第11染色体长臂上,同标记RM144共分离,并位于标记RM7654和RM6293之间,与两标记的遗传距离分别为1.1cM和0.7cM。【结论】小粒野生稻(Acc.No.101133)含有新的抗白叶枯病基因,暂定为Xa35(t)。

小粒野生稻优异基因的挖掘与利用研究进展

小粒野生稻拥有丰富的遗传多样性,含有大量的优异基因,是进行栽培稻遗传改良和基因组研究的宝贵资源。本文总结了国内外研究利用小粒野生稻种质取得的系列进展,主要包括:小粒野生稻优异性状的鉴定和遗传群体的构建,小粒野生稻有利基因的定位、克隆与育种利用,还对小粒野生稻优异基因利用的困难和应对策略进行了讨论。这些结果必将有利于进一步挖掘和利用小粒野生稻的有利基因。

小粒野生稻导入系对稻飞虱的抗性鉴定与分析

稻飞虱是水稻生产最严重的害虫之一。野生稻拥有丰富的抗虫基因资源,导入系是鉴定和利用野生稻有利基因的有效途径。本研究通过对371份小粒野生稻导入系进行抗褐飞虱和白背飞虱接虫鉴定,分别筛选出了11份抗、72份中抗褐飞虱的材料和7份抗、45份中抗白背飞虱的材料,其中有5份材料兼抗褐飞虱和白背飞虱,这是从小粒野生稻中鉴定出抗白背飞虱材料的首次报道。通过对2份抗性导入系材料与感虫亲本杂交构建的F1和F2群体的抗虫鉴定和分析表明:K41对褐飞虱和白背飞虱的抗性受2对显性抗虫基因通过互补作用所控制;P114对褐飞虱和白背飞虱的抗性都是由1对主效的隐性基因控制。这些结果必将有利于小粒野生稻抗稻飞虱的基因定位和育种利用。

小粒野生稻基因渗入系抗褐飞虱QTL定位

【目的】研究小粒野生稻（Acc．No．101133）褐飞虱抗性QTL和连锁的分子标记，为水稻褐飞虱抗性育种提供理论依据和育种材料。【方法】采用标准苗期集团法对一套小粒野生稻的基因渗入系进行褐飞虱抗虫鉴定，应用Windows QTL Cartographer 2．5软件的复合区间作图法分析小粒野生稻含有的褐飞虱抗性QTL。【结果】IR24的死苗率为92．2％，表现高感；小粒野生稻的死苗率为11．1％，表现高抗；131份基因渗入系的死苗率差异较大，变异范围为15．5%-91．1％，呈偏态型连续分布。鉴定获得3个褐飞虱抗性QTL，来自小粒野生稻的等位基因均能显著降低幼苗死亡率，联合贡献率为58．8％；qBph3位于第3染色体RM570-RM85区间，qBph4位于第4染色体RM335-RM518区间，qBph12位于第12染色体RM309～RMl7区间，以qBph4的效应值最大，效果最稳定。与IR24相比，携带纯合等位基因qBph4的9个基因渗入系的幼苗平均死亡率极显著下降37．7％。【结论】从小粒野生稻基因渗入系中鉴定出3个褐飞虱抗性QTL位点；抗褐飞虱主效QTLqBph4的验证不仅提供了一个有用的QTL，还为水稻的遗传改良提供了一套褐飞虱抗性育种材料。

小粒野生稻导入系子粒大小和形状的QTL定位

通过AB-QTL分析法,应用Windows QTL Cartographer 2.5软件,于2009～2010年分别在武昌和南宁对一套小粒野生稻（Oryza minuta）导入系的子粒大小、粒长、粒宽与子粒长宽比进行QTL定位.2009年检测到18个QTLs,其中千粒重、粒长、粒宽和子粒长宽比分别检测到6、4、5和3个QTLs,单个QTL可解释表型贡献率的5.18％～21.33％;2010年检测到12个QTLs,其中千粒重、粒长、粒宽和子粒长宽比分别检测到6、2、2和2个QTLs,单个QTL可解释表型贡献率的6.68％～16.55％.两年均检测到的QTLs共有10个,其中4个新鉴定的QTLs的表型贡献率较大,分别为qTGW-9.2、qTGW-12、qGL-9和qGW-12,其增效基因均来自于小粒野生稻.这些携带有利QTL的小粒野生稻导入系是进行水稻（Oryza sativa）产量和品质改良的优良材料.

广西邕宁普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)种群遗传多样性及核心种质构建研究

[目的]研究广西邕宁普通野生稻种群的遗传多样性和核心种质构建,为普通野生稻种群保护提供依据。[方法]从水稻12条染色体上均匀选取24对SSR标记对243份样本进行遗传多样性分析。[结果]结果表明,24对引物均表现出多态性,多态位点比率为100%;24个多态位点共检测出103个等位变异,平均等位基因数A为4.291 7,平均有效等位基因数E是2.511 2,平均期望杂合度He为0.573 2,平均多态信息含量PIC为0.572 0。根据聚类结果分析,从243份材料中筛选出31份核心种质,包含了24个SSR位点检测到的所有的遗传变异,其平均期望杂合度He是0.595 8,平均多态信息含量PIC是0.586 3,基本上可以代表广西邕宁普通野生稻种群的遗传多样性。[结论]广西邕宁普通野生稻资源具有丰富的遗传多样性。

小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建

采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。

小粒野生稻对褐稻虱抗性机制的研究

通过应用改良苗期群体筛选法 ,对小粒野生稻进行了抗性鉴定 ,并根据褐稻虱在抗性品种上的生存率、发育进度、蜜露分泌量、群体建立、虫体重量变化、卵巢发育程度、产卵量和稻株的受害级别等指标与感虫对照品种 TN1上的差异显著性作比较 ,综合评定了小粒野生稻对褐稻虱的抗性机制。试验结果表明 ,小粒野生稻对褐稻虱的抗性级别为 0级 ,属高抗褐稻虱。在小粒野生稻上 ,褐稻虱的生存率为 18% ,蜜露分泌量为 6 .0 4mm2 ,群体建立为 2 1.8头 /对 ,体重增量为 - 0 .33mg,卵巢发育为 2 .9级 ,产卵量为 2 9.6 7粒 /雌 ;而在感虫对照品种 TN1上 ,褐稻虱的生存率为 82 % ,蜜露分泌量为 46 .8mm2 ,群体建立为 2 17.0头 /对 ,体重增量为 2 .2 7mg,卵巢发育为 4.8级 ,产卵量为 2 2 9.3粒 /雌。由此可知 。

小粒野生稻STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(serine-threonine kinase,STK)抗病基因结构中保守结构域,设计引物,以小粒野生稻基因组DNA为模板,扩增获得10条STK类抗病基因同源序列.同源性分析表明其都具有STK保守结构域,与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小粒野生稻中的STK类抗病基因提供依据.

小粒野生稻对褐稻虱抗性物质的研究

测定了不同水稻品种叶鞘内游离氨基酸及草酸的含量 ,并对草酸对褐稻虱的生物活性进行了测定 .试验结果表明 :水稻叶鞘内含有 2 1种游离氨基酸 ,在小粒野生稻中 ,氨基酸总量及天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸等 6种主要游氨基酸含量分别为 :40 5 7.9、2 15 .0、30 8.3、6 11.8、5 71.2、192 .1和 94.7μg/g ,均低于感虫品种TN1中的含量 .此外 ,小粒野生稻内草酸含量为 0 .38mg/g 。

转小粒野生稻基因种质野威B的产量与米质性状

野威B是将小粒野生稻(Oryzaminuta)的基因组DNA通过穗茎注射法导入杂交水稻亲本V20B中培育出的转基因水稻新种质。与亲本V20B相比,野威B的有效穗数和每穗总粒数小于V20B,但每穗实粒数却高于V20B,平均结实率比V20B增加11.8%,千粒重比V20B的少6g。野威B倒1叶和倒2叶叶鞘中可溶性糖含量先降低,黄熟期略微升高,蜡熟期降低;V20B倒1叶叶鞘中可溶性糖含量变化不明显,倒2叶叶鞘中可溶性糖含量先升高,乳熟期降低,之后升高。野威B的糙米率和整精米率与V20B相近,垩白粒率比V20B降低47.5%,垩白面积下降62.1%,胶稠度比V20B的高,直链淀粉含量比V20B降低39.0%。

小粒野生稻可转化人工染色体文库初步构建及筛选

以小粒野生稻核DNA为材料构建了一个可转化人工染色体文库,获得了5000个克隆,平均插入片段约45 kb。稳定性检测结果表明,小粒野生稻基因组DNA能够在TAC载体中稳定存在。基于已克隆抗性基因的保守序列设计探针,利用菌落杂交的方法,对文库进行筛选。结果表明,该文库可以用于抗性基因的筛选。

小粒野生稻产量相关性状的QTL定位

【目的】利用导入系群体检测来自小粒野生稻产量相关性状的有利QTL,为水稻超高产育种提供新的基因资源。【方法】利用小粒野生稻与栽培稻IR24构建的高代回交导入系,通过早、晚两季的重复试验,应用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法对该群体进行每株穗数(PNR)、单穗长(PLH)、千粒重(TGW)、每穗实粒数(FGP)、每穗总粒数(SPP)、单株重(YGP)等6个产量相关性状的QTL检测及遗传效应分析。【结果】早、晚两季分别检测到20和17个与产量相关的QTL,其中,控制每株穗数、单穗长、千粒重、每穗实粒数、每穗总粒数和单株重的QTL分别有3、6、6、4、3和5个。两季均检测到的QTL有10个,分别为单穗长QTL q PLH-2、q PLH-5,千粒重QTL q TGW1.1、q TGW3、q TGW9、q TGW12,每穗总粒数QTL q SPP-1,单株重QTL q YGP-1.2、q YGP-3、q YGP-12,其平均表型贡献率分别为7.38%、10.01%、8.51%、14.66%、10.23%、17.00%、6.80%、7.69%、20.35%和16.23%。【结论】两季共检测到13个来自小粒野生稻的有利QTL,其中q PLH-2、q TGW-1.1、q TGW-9、q TGW-12、q SPP-1、q YGP-12等6个QTL在两季试验中均稳定表达,推测其可能在超高产育种方面发挥重要作用。

小粒野生稻与栽培稻远缘杂交探讨

以2份小粒野生稻和4份不同类型栽培稻为材料,探讨不同杂交方式、去雄和授粉方法对小粒野生稻与栽培稻杂种幼胚获得率的影响以及不同胚拯救技术(灭菌剂20%NaClO或0.1%HgCl2、接种材料、培养基种类和幼胚胚龄)对杂种幼胚发芽率的影响。结果表明:采用栽培稻作母本、小粒野生稻为父本,人工剪颖去雄,连续3d授粉的杂种幼胚获得率较高。取授粉后10～12d的幼胚,用0.1%HgCl2进行10min灭菌处理,以部分子房为培养材料,在1/4MS培养基上进行胚拯救,其杂种幼胚发芽率较高,并获得小粒野生稻与栽培稻的杂种植株,说明该方法在非AA基因组野生稻与栽培稻的杂交中可以应用,且方法简便易行、经济实用。

RecA蛋白介导的小粒野生稻STK类抗性基因富集文库的构建

利用RecA蛋白的同源重组特性,以生物素标记的STK类抗性基因PCR扩增产物为探针,对小粒野生稻DNA文库进行富集,构建了库容量为1 710个的STK类抗性基因富集文库,通过菌落原位杂交筛选获得21个阳性克隆.其中10个阳性克隆进行了两端测序,生物信息学分析表明:有3个阳性克隆可分别定位于粳稻抗性基因附近和抗性基因内,可能是新的候选抗性基因;有2个阳性克隆可以在粳稻上定位,但周围无抗性基因片段;其它5个阳性克隆由于与栽培稻有多处匹配,不能精确定位。

转小粒野生稻基因组DNA水稻的光合性状研究

通过"穗茎注射法",将远缘物种小粒野生稻(Oryza minuta)的基因组DNA导入杂交水稻亲本V20B中,培育出转基因水稻新种质野威B。与亲本V20B相比,野威B的株型较松散,茎较细小,其倒1、倒2和倒3叶的叶面积均显著小于亲本的。从始穗期(Ⅰ期)、齐穗期(Ⅱ期)到乳熟期(Ⅲ期)再到黄熟期(Ⅳ期)和腊熟期(Ⅴ期),野威B和V20B的叶绿素含量逐渐降低,两者之间差异未达到显著水平,但野威B的倒1、倒2和倒3叶片的光合速率均极显著高于亲本V20B的光合速率。

小粒野生稻渗入系抗南方水稻黑条矮缩病QTL分析及利用

为杂交水稻南方水稻黑条矮缩病抗性育种提供基础材料和理论依据,对来源于小粒野生稻基因渗入系的抗病材料桂恢1561和感病材料桂1025的重组自交系株系进行南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定,并利用QTLNetwork-2.2软件对重组自交系的南方水稻黑条矮缩病抗性进行QTL定位。结果表明:从210份重组自交系株系中鉴定获得对南方水稻黑条矮缩病抗及中抗的株系材料共计31份,其中,配合力较高的株系有7份;定位到4个抗性QTL(qSRBSDV3、qSRBSDV4、qSRBSDV7和qSRBSDV12),qSRBSDV3位于第3染色体RM5548~RM85区间,qSRBSDV4位于第4染色体RM3471~RM518区间,qSRBSDV7位于第7染色体RM5508~RM1135区间,qSRBSDV12位于第12染色体RM7102~RM1261区间,其中qSRBSDV4为主效抗性位点。

筛选和转化药用野生稻TAC克隆获得耐旱水稻

【目的】利用分子生物学技术建立一种可有效转移药用野生稻有利基因的方法,为进一步大量开展利用药用野生稻有利基因提供技术基础。【方法】以植物抗性相关转录因子AP2/EREBP和bZIP家族基因保守序列为探针,采用同位素α-32P对探针进行标记,通过Southern杂交对药用野生稻TAC文库进行第一轮筛选;所获得阳性克隆用地高辛标记的探针进行第二轮筛选;最后利用PCR方法对第二轮筛选所获得的阳性克隆进行验证。通过农杆菌介导法将阳性克隆转入栽培稻品种日本晴,利用TAC载体插入片段两端的抗性标记Hpt和SacB,通过PCR扩增检测和和Southern杂交对转化植株进行鉴定。采用PEG胁迫法和生理指标变化对转基因T2植株的芽期、苗期耐旱性进行鉴定。【结果】第一轮TAC文库筛选共获得1 073个阳性克隆,其中,以AP2/EREBP的保守序列为探针筛选出606个、bZIP为探针筛选出467个。对这些阳性克隆进行第二轮筛选,从中共获得147个阳性克隆,其中,AP2/EREBP为探针筛选出95个、bZIP为探针筛选出52个。PCR验证有103个阳性克隆能够扩增出目的片段,分别是利用AP2/EREBP设计的引物筛选出63个克隆和bZIP的40个克隆,阳性克隆得率分别为66.32%和76.92%。通过农杆菌转化,以编号为52D-M16和22D-P2(与AP2/EREBP相关)以及55R-A17、49R-O14和8-A24(与bZIP相关)的克隆转化水稻日本晴均获得转化植株,转化试验结果发现外源插入片段越大则克隆转化的成苗率越低。抗性鉴定、PCR和Southern杂交结果均证明外源片段已转入受体水稻品种日本晴中。芽期抗旱性鉴定表明R12-23、R15-41和R1-8 3份材料的耐旱性优于受体日本晴,苗期鉴定显示M63-9和R12-23的耐旱性较强。综合认为,R12-23具有较好的耐旱性。【结论】通过构建药用野生稻TAC文库并结合特异克隆筛选和遗传转化方法,可以进行有利基因的转移,结合进一步的育种,有望实现药用野生稻在育种上的利用。