温州市食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因分布及遗传多样性研究

目的了解温州市食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力基因分布及遗传多样性特征。方法对温州市食品及食源性疾病腹泻病人中分离得到的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行生物型、血清型和耐药性分析,并基于全基因组测序进行菌株的毒力基因、多位点序列分型(MLST)、核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析。结果71株食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌,94.4%(67/71)的分离株为生物1A型,生物血清型以1A/O∶5占比最高(29.6%,21/71)。分离株对14种抗菌药物的敏感率达到95.8%以上。共获得了16种126个毒力基因,其中2株菌株携带pYV质粒和染色体相关毒力基因。分离株以ST3型最常见(31.6%,12/38),cgMLST分析显示除具有相同ST型的菌株外,菌株无明显基因型簇形成。结论温州市食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌存在致病性菌株,菌株呈高度遗传多态性,需加强此类菌株的监测,以预防其引起食源性疾病的暴发。

麝香草酚破坏小肠结肠炎耶尔森氏菌细胞膜并抑制其生物被膜的形成研究

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是食品工业中常见的致病菌,其生物被膜是主要的污染源.为了阐明麝香草酚对Y.enterocolitica的抑制机制,本研究首先测定了最小抑制浓度(MIC)、最小抑制生物被膜浓度(MBIC)和最小清除生物被膜浓度(MBEC),随后检测了细胞膜电位以及细胞内ATP和pH值的变化,最后在激光共聚焦显微镜(CLSM)、场发射扫描电子显微镜(FEGSEM)和光学显微镜下,直接观察了麝香草酚引起的细胞膜损伤及其对生物被膜的抑制作用.结果显示,麝香草酚对Y.enterocolitica的MIC为0.156 25 mg/mL,MBIC仅为1/16 MIC,改变了细胞形态并导致胞内ATP降低、膜去极化和pH下降.旨在探索麝香草酚抑制Y.enterocolitica及其生物被膜的机理,从而为麝香草酚能否作为植物源天然防腐剂提供更多参考.

小肠结肠炎耶尔森氏菌生物膜和浮游态的蛋白质组学对比分析

小肠结肠炎耶尔森氏菌是革兰氏阴性食源性致病菌,能够在食物以及食品加工设备表面形成生物膜。生物膜可以增强菌株的生存能力并危害食品安全。该文以分离自速冻食品且具有强生物膜形成能力的小肠结肠炎耶尔森氏菌C1967-1作为出发菌株。通过蛋白质组分析生物膜与浮游态细菌中的蛋白表达差异。GO富集分析表明富集程度最大的前9个GO条目中,7个条目在生物膜中呈现下调趋势。仅GO:0046873(金属离子跨膜转运蛋白活性)条目在生物膜中未呈现明显上下调趋势。KEGG富集结果表明富集程度最大的前20个KEGG通路主要涉及碳水化合物、氨基酸和脂质的代谢过程。亚细胞定位分析结果表明,45.65%的差异蛋白位于细胞质内。为进一步验证蛋白质组数据,从GO:0046873条目中筛选出生物膜上调蛋白MgtA并敲除基因mgtA。结果表明,mgtA的敲除没有抑制菌株的生长,但ΔmgtA的生物膜量下降约80%且生物膜结构松散。综上所述,研究结果为小肠结肠炎耶尔森氏菌生物膜形成机制以及其在食品行业生物膜防控提供重要理论依据。

小肠结肠炎耶尔森氏菌分子生物学检测技术研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)是一种重要的食源性致病菌,可以引起人类的耶尔森氏菌病,该病的典型症状为腹泻、回肠炎和肠系膜淋巴结炎等。由于该菌在特定食品(如肉与肉制品)中的检出率较高,因此对食品安全构成一定的威胁。就现有的检测方法而言,分离纯化和生理生化鉴定方法耗时且难以检测出复杂食品基质中低浓度的小肠结肠炎耶尔森氏菌。所以,研发能够快速、准确地检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴别方法迫在眉睫。该研究将小肠结肠炎耶尔森氏菌现有的分子生物学检测方法分为两大类:变温扩增技术和等温扩增技术进行相关研究最新进展的总结,并对其优缺点和发展方向进行讨论,以期为小肠结肠炎耶尔森氏菌快速检测方法研究提供参考。

小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体的研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体对宿主具有专性感染特性,不仅可以杀灭细菌,而且可以作为食源性病原菌存在的指示器应用于食品、水和环境污染预警系统中。从受体、研究情况和应用三方面对国内外关于小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体的研究进行综述,对其在养殖业、食品去污、保鲜以及卫生检测等方面的应用进行展望。

不同动物宿主小肠结肠炎耶尔森氏菌分离及结果分析

目的了解中国不同地区小肠结肠炎耶尔森氏菌在不同动物宿主中分布状况。方法采集我国不同地区的家畜家禽以及啮齿动物等标本进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分离,并对分离到的菌株进行血清分型、生物分型及毒力基因检测。结果从3 386份标本中分离出134株小肠结炎耶尔森氏菌,分离率为3.96%;其中致病性菌株(ystA+ail+virF+yadA+ystB-)30株(22.39%),均为O∶3/3型。非致病性菌104株(ystA-ail-virF-yadA-ystB+或者ystB-)(77.61%)。结论结果表明,我国致病性小肠结肠炎耶尔森菌以O:3/3型为主,猪的分离率最高为6.28%;依次为旱獭、鼠,分别为4.05%、3.41%。

小肠结肠炎耶尔森氏菌主要毒力基因分析

目的了解南京地区从不同来源分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因的分布情况。方法聚合酶链反应(PCR)技术进行不同血清生物型菌株的毒力基因检测。结果从血清型来看,分离到的9株血清型O:3菌株有7株的基因型分布为ail+,ystA+,ystB-,virF+,yadA+。从生物型来看,共分离到致病生物型(3,4)菌株12株,其中9株毒力基因分布特征为ail+,ystA+,ystB-,virF+,yadA+。结论本市小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型O:3菌均包含毒力基因,毒力基因主要分布特征为ail+,ystA+,ystB-,virF+,yadA+。所有的致病生物型(3,4)菌株,均包含染色体上的毒力基因ail,毒力基因主要分布特征亦为ail+,ystA+,ystB-,virF+,yadA+。ail与致病生物型之间存在明显关联。

小肠结肠炎耶尔森氏菌滚环扩增检测方法的建立

根据滚环扩增的原理设计引物、锁式探针以及反应体系,建立和优化了滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)检测体系,构建可快速检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的RCA检测方法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立的RCA检测方法,具有很好的特异性,灵敏度为1.7×102CFU/mL,高于普通PCR方法。小肠结肠炎耶尔森氏菌RCA检测方法具有较高的灵敏度和特异性,适合在细菌快速检测方面应用。

江黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生物学特性研究

从发病江黄颡鱼中分离出菌株YER6022,通过细菌培养、生理生化试、16SrDNA基因扩增等方法对其生物学特性进行研究.结果表明:该菌株为革兰氏阴性球杆菌,具有动力性,不发酵山梨醇,赖氨酸、苯丙氨酸阴性,尿素、鸟氨酸阳性.16SrDNA片段测序为1408bp,与小肠结肠炎耶尔森氏菌相似性达99%,GenBank登录号为JX434637.系统进化树显示菌株YER6022与耶尔森菌属的小肠结肠炎耶尔森菌亲缘关系最近.

进口冻肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌检出情况分析

目的:了解我国进口冻肉产品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出情况,为此类产品的风险分析和检验检疫工作提供依据。方法:通过采用小肠结肠炎耶尔森氏菌的国标检验方法和VITEK、API生化鉴定仪对247份进口冻肉产品进行检测。结果:247份样品中共检出耶尔森属菌33份,其中17份为小肠结肠炎耶尔森氏菌,检出率为6.88%,均属于生物1A型,其中3株为血清O:8型,其余均属非常见血清型。阳性样品中16份为冻鸡类样品,1份为冻猪肉类样品。94份海产样品无一份检出。结论:通过实验数据分析我国进口的冻肉产品中冻鸡类产品检出小肠结肠炎耶尔森氏菌比率较高,而海产品和冻猪肉产品中检出率相对较低,所以认为冻鸡类产品小肠结肠炎耶尔森氏菌污染风险较高,应加强此类产品检验监管力度。

食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌生物学特性和分子分型研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是一种重要的嗜冷肠道致病菌,研究表明Y.enterocolitica血清型有60多种,我国致病性菌株生物/血清型以3/O:3和2/O:9型为主;另外Y.enterocolitica具有1A、1B、2、3、4、5共6个生物型,除了1A型可能具有潜在致病性外,其他5个已确定具有致病性,且1B为高致病性菌株;主要毒力因子有ail、ystA、ystB、yadA和virF,常用来判断小肠结肠炎耶尔森菌的致病性;Y.enterocolitica对氨苄西林和一代头孢类抗生素天然耐药,对其他抗生素有不同程度耐药性,并且许多菌株具有多重耐药性.常用的分子分型方法有脉冲场凝胶电泳、扩增基因重复序列、多位点序列分型等,其中具有操作简便和多态性高的ERIC-PCR在Y.enterocolitica分型中也将发挥较好作用.

小肠结肠炎耶尔森氏菌对黄颡鱼的致病性及毒力基因检测

为研究小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株GM2402对黄颡鱼的致病性及毒力基因分布,采用动物回归感染试验方法探讨菌株对黄颡鱼的致病性,利用PCR技术扩增毒力基因,通过药物敏感试验检测该菌株对抗生素的敏感性。在动物回归感染试验中,试验处理组鱼7d内的死亡率达100%,从感染后的试验鱼体中再次分离到小肠结肠炎耶尔森氏菌,证实了该菌株具较强致病性;成功扩增到粘附侵袭位点、耐热肠毒素、粘附素、毒力活化因子和强毒力岛上P4样噬菌体整合酶5种毒力基因,揭示毒力基因与致病性密切相关。菌株GM2402对卡拉霉素、恩诺沙星、磺胺异恶唑等9种药物高度敏感,对氟苯尼考、先锋霉素V中度敏感,而对链霉素、洁霉素等5种药物表现为耐药,这将为鱼类小肠结肠炎耶尔森菌病的有效防治提供参考。

广州地区食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌分布特性的初步研究

目的:了解广州地区食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分布特性。方法:采用随机抽样方法分别对广州十区两市日常监测的样品,共计207份,参照国标方法进行小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测和鉴定,并对分离菌株的生物分型、血清型分型、毒力基因携带等特征作分析。结果:207份样品中14份检出小肠结肠炎耶尔森氏菌,阳性率为6.22%。分离到O:1,2、O:5、O:8三种血清型的菌株。14株菌株均为非致病的生物1A型,其中8株携带毒力基因ystB,3株携带yadA基因。冬、春季的分离率比夏、秋季的高(χ2检验,P<0.005)。结论:本地区食品中存在小肠结肠炎耶尔森氏菌的污染,以非流行株为主。应加强本地区食品加工、流通方面的监督管理,以减少可能引起食源性疾病的因素。

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10^1cfu/mL,当每25g样品中有10^0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。

鱼源小肠结肠炎耶尔森氏菌的耐药性研究

本试验采用聚合酶链反应(PCR)方法检测鱼源小肠结肠炎耶尔森氏菌的四环素类耐药基因(tetA、tetC、tetM)、磺胺类耐药基因(sul1、sul2、sul3)和氨基糖苷类耐药基因(aph(3')-Ⅲa、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa),并采用κ-B法检测该菌对14种抗生素的耐药表型。结果表明,小肠结肠炎耶尔森氏菌8种耐药基因(tetC、tetM、sul1、sul2,aph(3')-Ⅱa、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa)被检测出,而tetA、sul3基因未被检测出。该菌株对复方新诺明、磺胺异恶唑、红霉素、利福平、洁霉素和头孢噻吩6种抗生素耐药,对氟哌酸、氟苯尼考和头孢曲松等8种抗生素敏感。这为治疗小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的鱼病积累了资料。

青藏高原放牧家畜小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP检测方法的建立及应用

为了建立特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法,采用分子生物学方法,根据GenBank数据库中该细菌的outL基因,进行了多序列比对和保守区域确定。根据其保守序列,在线设计和筛选了一套LAMP引物。温度优化及特异性和敏感性验证后建立了检测该病菌的LAMP检测方法,并对青藏高原放牧牛、羊临床粪便样品进行了检测。结果表明,LAMP检测方法的最适温度为63℃;检测其与大肠杆菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌及蜡样芽胞杆菌无交叉反应;检测下限为100 fg目的基因;利用建立的方法检测了208份放牧牦牛、藏羊粪便DNA样品,共检测到26份阳性样品,阳性率为12.5%。这表明成功建立了一种检测该病的特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法。

冷却猪肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌生长动力学模型的建立和评价

将特定的小肠结肠炎耶尔森氏菌(以下简称耶氏菌)接种到无污染的冷却猪肉表面,托盘包装后分别在0、5、10和15℃条件下贮藏,将不同温度下得到的耶氏菌生长实验值用于建立其生长动力学模型,结果表明修正Gompertz方程能很好地描述耶氏菌在冷却猪肉中的生长动态。lgNmax(最大菌数)受贮藏温度的影响不大,在4种温度下平均值为9.259±0.83(log10cfu/g)。温度对μmax(最大比生长速率)和Lag(延滞时间)的影响,采用平方根模型(Belehradek)描述呈现良好线性关系。用贮藏在3℃、8℃下耶氏菌的生长实验值验证建立的模型,偏差度分别为0.92、0.97,准确度分别为1.09、1.04,表明所建立的耶氏菌生长动力学模型的可靠性很好。

黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rDNA及系统发育分析

从发病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)心脏中分离到1株细菌GM 2402,进行了分离培养、形态学观察、生理生化试验与16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析。结果表明,菌株GM 2402为革兰氏阴性杆菌,具动力性,V-P试验、水杨酸、过氧化氢酶、脲酶等阳性,不发酵鼠李糖、乳糖等,硫化氢、枸椽酸盐等阴性。16S rDNA序列长1 417 bp,GenBank的登录号是JX 101598,且与数据库中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的相似性高达99.6%,系统发育树显示与小肠结肠炎耶尔森氏菌聚为一个分支。综合菌株的生化特性及分子生物学分析结果,判定菌株GM2402为小肠结肠炎耶尔森氏菌。

RF-LAMP技术检测鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌

本研究建立实时荧光环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定,表明扩增结果正确。本研究验证该方法特异性,对灵敏度和人工污染鸡肉的检出限进行测定。结果表明小肠结肠炎耶尔森氏菌株呈阳性结果,非小肠结肠炎耶尔森氏菌株均呈阴性结果。该方法检测纯菌的灵敏度为61 CFU/m L,人工污染鸡肉的检出限为46 CFU/g。该方法特异性强、灵敏度高、可实时检测小肠结肠炎耶尔森氏菌,能够实现对小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。