小胶质细胞/脑巨噬细胞与胶质瘤研究进展

胶质瘤是脑肿瘤中最常见的类型,其强大的侵袭力是一个非常棘手的临床问题,恶性肿瘤侵袭转移机制是肿瘤学研究的热点。小胶质细胞/脑巨噬细胞在胶质瘤的发展及侵袭过程中具有两方面作用,可以在胶质瘤微生态环境中通过胶质瘤分泌释放细胞因子调控促进胶质瘤的增生扩张,也能在人为作用影响下发挥肿瘤免疫作用。小胶质细胞/脑巨噬细胞透过血脑屏障改变肿瘤微生态环境使其表现为抑制胶质瘤侵袭扩张,将可能为胶质瘤的研究及治疗提供新思路和方法。

小胶质细胞/脑巨噬细胞与胶质瘤相互关系的研究进展

胶质瘤相关巨噬细胞(glioma-associated microglia and macrophages,GAMs)在胶质瘤的发生和发展中扮演重要角色。GAMs既可以参与胶质瘤免疫抑制微环境的形成,也可以促进胶质瘤细胞的增殖及侵袭。本文就GAMs与胶质瘤的关系做一综述,以期为胶质瘤治疗提供新的策略。

血清tau蛋白和巨噬细胞炎性蛋白1α及胶质纤维酸性蛋白与高血压脑出血后血脑屏障的关系

目的探究血清tau蛋白、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平与高血压脑出血后血脑屏障损伤的关系。方法纳入2020年8月至2022年12月阳光融和医院收治的高血压脑出血患者180例作为研究组,选取同期来我院体检的健康人群180例作为对照组。根据白蛋白商值(QAlb)评估患者血脑屏障损伤,将研究组180例患者分为轻度组83例(QAlb 7.5~10)、中度组54例(10<QAlb≤30)、重度度组43例(QAlb>30)。对研究组180例患者展开6个月随访,根据改良的Rankin量表(mRS)评分评估预后,分为预后良好组119例(mRS评分0~2分)和预后不良组61例(mRS评分3~6分)。检测血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平,分析血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平与患者血脑屏障损伤和预后的关系。结果研究组血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平显著高于对照组(P<0.01)。中度组、重度组tau蛋白水平显著高于轻度组,重度组MIP-1α和GFAP水平显著高于轻度组(P<0.05)。预后不良组血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平显著高于预后良好组(P<0.01)。血清tau蛋白(r=0.532,P=0.000)、MIP-1α(r=0.487,P=0.001)和GFAP(r=0.571,P=0.000)分别与QAlb呈正相关。血清tau蛋白(r=0.507,P=0.000)、MIP-1α(r=0.425,P=0.004)和GFAP(r=0.533,P=0.000)分别与mRS评分呈正相关。ROC曲线分析显示,血清tau蛋白和MIP-1α及GFAP三者联合评估患者预后的曲线下面积为0.848(95%CI:0.787~0.897,P=0.000),显著高于三者单一检测。结论高血压脑出血患者血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平较健康人群明显升高,与脑出血后血脑屏障损伤程度和预后密切相关。

巨噬细胞极化调控因子在脑卒中康复中的表达变化及其与认知功能恢复的关系

目的探讨巨噬细胞极化调控因子[干扰素调控因子8(IRF8)]在脑卒中康复中的表达变化及其与认知功能恢复的关系。方法这是一项横断面回顾性队列研究,数据来自2021年1月—2023年1月在保定市第二中心医院接受治疗的急性缺血性卒中患者,并在卒中后2周使用简易精神状态检查量表确定了卒中后认知障碍(PSCI)组(n=76)和非PSCI组(n=42)。RT-qPCR用于分析外周血单个核细胞(PBMCs)中IRF8基因表达。通过二元逻辑回归进行研究IRF8基因表达和认知结果之间的联系。结果PSCI组PBMCs中IRF8 mRNA表达显著高于非PSCI组(P<0.001)。在IRF8 mRNA三分位数中观察到PSCI和非PSCI患者比例的显著差异[T1:53.8%(21/39),T2:64.1%(25/39),T3:75.0%(30/40),χ2=8.082,P=0.018]。在Logistic回归分析中,IRF8 mRNA表达最高的三分位数(>0.024)(OR=1.956,P<0.001)、年龄(OR=1.062,P<0.001)、NIHSS评分(OR=1.145,P=0.014)、血红蛋白(OR=1.194,P=0.024)与PSCI风险较高显著相关。当截断值为0.01时,IRF8 mRNA预测PSCI的AUC为0.682,准确率为71.49%,特异度为50.24%,敏感度为71.42%。将IRF8 mRNA、年龄、NIHSS评分、血红蛋白纳入列线图中,其预测PSCI的AUC为0.862。结论缺血性卒中入院时PBMCs中IRF8 mRNA表达与卒中后急性期的PSCI相关。

胶质瘤条件培养基促进巨噬细胞糖酵解及表型转化

目的初步探索胶质瘤条件培养基诱导巨噬细胞糖酵解代谢与促癌介质表达的作用与机制。方法以经过缺氧与小鼠胶质瘤细胞系GL261条件培养基(GCM)诱导后的骨髓来源巨噬细胞(BMDM)(GCM-BMDM)为体外胶质瘤相关巨噬细胞(GAMs)模型,通过qPCR检测GCM-BMDM中M1与M2促癌介质、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与糖酵解相关代谢酶基因mRNA水平;采用Seahorse细胞能量测定方法检测GCM-BMDM细胞外酸化速率(ECAR);通过Western blot检测信号传导与转录激活因子6(STAT6)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)及其磷酸化形式p-STAT6、p-STAT3蛋白水平。结果GCM刺激BMDM Hif-1α与多种M1、M2促癌介质mRNA表达(P<0.01);GCM上调BMDM多种糖酵解基因mRNA表达(P<0.01),升高糖酵解水平(P<0.001),加入乳酸脱氢酶抑制剂stiripentol(STP)处理后糖酵解水平降低(P<0.05);STP下调GCM-BMDM Hif-1α与促癌介质Il-1β、Il-6、Ido与Cd163 mRNA水平(P<0.01);STP下调GCM-BMDM p-STAT3/STAT3与p-STAT6/STAT6比值(P<0.05)。结论GCM增加糖酵解代谢,促进HIF-1α、STAT3与STAT6介导的转录调控机制以诱导GAMs的促癌表型。STP能有效抑制GAMs糖酵解并降低GAMs促癌介质的转录表达水平。

G-CSF介导的小胶质细胞自噬活性降低在大鼠酒精使用障碍脑卒中中的脑保护作用研究

目的探讨大鼠酒精使用障碍(AUD)脑卒中后粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗对小胶质细胞自噬活性的影响及其神经保护作用。方法将54只SD雄性大鼠按照随机数字表法分为AUD组、AUD+大脑中动脉栓塞(MCAO)组、AUD+MCAO+G-CSF组,每组各18只。AUD组用20%酒精双瓶法构建AUD大鼠模型,AUD+MCAO组、AUD+MCAO+G-CSF组均在AUD模型基础上制作MCAO局部脑缺血模型,AUD+MCAO+G-CSF组大鼠缺血再灌注损伤1 h后腹腔注射G-CSF 50μg/kg治疗。每天记录所有大鼠的酒精摄入量及偏好。观察各组大鼠脑缺血再灌注损伤24 h后检测脑梗死面积和神经功能评分。采用免疫荧光染色及蛋白质印迹法检测各组大鼠缺血侧大脑皮层小胶质细胞特异性标志物TMEM119、自噬标记物LC-3的表达水平。结果到末次饮酒28 d时酒精摄入量已达到稳定水平,酒精偏好明显增加。与AUD组比较,AUD+MCAO组的脑梗死面积显著升高,神经功能评分显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与AUD+MCAO组比较,AUD+MCAO+G-CSF组的脑梗死面积明显减少,神经功能评分明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示:与AUD组比较,AUD+MCAO组TMEM119和LC-3蛋白表达荧光强度明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05);与AUD+MCAO组比较,AUD+MCAO+G-CSF组TMEM119和LC-3蛋白表达荧光强度均明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,免疫荧光显示TMEM119和LC-3二者有明显共定位。蛋白质印迹法结果显示,TMEM119和LC-3在AUD组表达微弱,与AUD组比较,AUD+MCAO组TMEM119和LC-3蛋白表达均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与AUD+MCAO组比较,AUD+MCAO+G-CSF组TMEM119和LC-3蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论G-CSF通过降低小胶质细胞的自噬活性,在AUD脑损伤中发挥重要的脑保护作用。

巨噬细胞移动抑制因子抑制剂对蛛网膜下腔出血大鼠脑损伤的保护作用

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抑制剂对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠脑损伤的保护作用。方法将120只12月龄健康雄性大鼠按照随机数字表法分为假手术组、SAH组、小剂量、中剂量和大剂量抑制剂组,每组24只。采用枕大池二次注血法制作大鼠SAH动物模型,小剂量、中剂量和大剂量抑制剂组分别给予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg剂量MIF抑制剂注射大鼠腹腔,测定五组大鼠炎症因子、神经细胞凋亡、脑含水量、血脑屏障通透性和神经功能情况。结果大鼠脑组织白介素-1β、肿瘤坏死因子-α及白介素-6蛋白表达、神经细胞凋亡指数、脑水肿指数、伊文氏蓝含量及神经行为学评分五组间比较,差异均有统计学意义(F=76.406、62.664、64.106、40.211、24.869、60.229、43.664,均P<0.01),与假手术组比较,SAH组白介素-1β、肿瘤坏死因子-α及白介素-6蛋白表达、神经细胞凋亡指数、脑水肿指数和伊文氏蓝含量增高,神经行为学评分下降,差异均有统计学意义(P<0.01),MIF抑制剂腹腔注射可逆转上述作用,且呈剂量-疗效依赖关系(P<0.05)。结论MIF抑制剂对SAH大鼠脑损伤具有明显的保护作用,且呈量效关系。

急性脑梗死患者入院时Hcy、HMGB1、TLR4水平与单核巨噬细胞极化的相关性

目的探讨急性脑梗死(ACI)患者入院时同型半胱氨酸(Hcy)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)水平与单核巨噬细胞极化的相关性。方法选择2020年8月至2022年8月该院收治的107例ACI患者为病例组,另选取同期体检健康者50例为对照组,比较2组入院时血清Hcy、HMGB1、TLR4水平,比较2组单核巨噬细胞极化情况[M1型细胞比例、M2型细胞比例、M1/M2比值、M1型极化标志物(白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α)、M2型极化标志物(白细胞介素-10、转化生长因子-β)],分析ACI患者Hcy、HMGB1、TLR4水平与单核巨噬细胞极化的关系,分析ACI患者Hcy、HMGB1、TLR4水平与ACI患者预后的关系。根据ACI患者预后情况,将患者分为预后良好组和预后不良组,比较其血清Hcy、HMGB1、TLR4水平。通过受试者工作特征(ROC)曲线分析Hcy、HMGB1、TLR4对ACI预后的预测效能。结果与对照组比较,病例组血清Hcy、HMGB1、TLR4水平明显升高(P<0.05)。与对照组比较,病例组M1型细胞比例、M1/M2比值、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α水平明显升高(P<0.05),白细胞介素-10、转化生长因子-β水平明显降低(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,ACI患者血清Hcy、HMGB1、TLR4水平与M1型细胞比例、M1/M2比值、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α水平呈正相关(P<0.05),与白细胞介素-10、转化生长因子-β水平呈负相关(P<0.05)。与预后良好组比较,预后不良组血清Hcy、HMGB1、TLR4水平明显升高(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,Hcy、HMGB1、TLR4联合预测ACI预后的效能较高,其曲线下面积、灵敏度、特异度依次为0.840、77.80%、80.00%。结论Hcy、HMGB1、TLR4在ACI患者外周血中呈高表达,其水平与单核巨噬细胞极化及预后关系密切,有望成为ACI临床诊治的生物标志物。

自噬调控小胶质细胞极化在缺血性脑卒中的研究进展

缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、病死率高的特点。炎症在缺血性脑卒中的发生发展中起到重要作用。活化的小胶质细胞表现出促炎(M1)和抗炎(M2)两个不同的表型,调节小胶质细胞由M1向M2型转化是临床获益关键。研究表明自噬对小胶质细胞的表型转化起到关键调控作用。如何发挥自噬的调节作用,促进小胶质细胞向M2型转化,成为减轻脑卒中后继发性脑损伤的临床研究热点,本文以此为出发点综述自噬调控小胶质细胞极化在缺血性脑卒中的研究进展,旨在为本领域基础及临床研究提供参考。

中枢神经系统边界相关巨噬细胞在大脑稳态和脑疾病中作用的研究进展

随着中枢神经系统“免疫豁免”的观点被打破,越来越多的研究聚焦于免疫调节在中枢神经系统疾病中的重要作用。其中,中枢神经系统边界相关巨噬细胞(BAMs)在大脑稳态和脑疾病调节中的作用日益凸显。与长期定植在脑实质内的小胶质细胞不同,BAMs是特化的巨噬细胞群,包括硬脑膜、蛛网膜、软脑膜、血管周围间隙和脉络膜丛的巨噬细胞,它们发挥着免疫监测、脑脊液引流、抗原清除和物质交换等重要功能。我们拟对BAMs的起源、功能及其在大脑稳态和脑疾病中的作用进行综述,以丰富对BAMs维持大脑稳态机制的理解,并为阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的治疗提供新思路。

急性脑出血患者脑组织中小胶质细胞/巨噬细胞极化状态与血肿周围水肿的关系

目的探讨急性脑出血患者脑组织中小胶质细胞/巨噬细胞(MG/MP)极化状态与血肿周围水肿的相关性。方法选择2020年12月至2022年11月安阳市人民医院收治的急性脑出血患者52例为研究对象。所有患者行骨瓣开颅血肿清除术,获取手术通道上未受血肿侵犯的皮质区正常脑组织和血肿周围的破碎脑组织(血肿周围脑组织),采用Western blot法检测脑组织中炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的蛋白表达水平,采用荧光定量聚合酶链反应检测脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的mRNA表达水平,采用免疫荧光共聚焦技术检测脑组织中M1型、M2型MG/MP水平。收集患者手术前的CT影像资料,计算血肿周围相对水肿体积(r-PHE),根据r-PHE将患者分为高r-PHE组(2.0≤r-PHE<2.5)和低r-PHE组(1.5<r-PHE<2.0)。比较高r-PHE组与低r-PHE组患者血肿周围脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的mRNA相对表达量。结果血肿周围脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白和mRNA相对表达量显著高于正常脑组织(P<0.05);血肿周围脑组织与正常脑组织中IL-10、TGF-β蛋白和mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。血肿周围脑组织中M1型MG/MP和M2型MG/MP水平均显著高于正常脑组织(P<0.05)。高r-PHE组患者血肿周围脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量显著高于低r-PHE组(P<0.05);2组患者血肿周围脑组织中TGF-β、IL-10的mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论急性脑出血患者血肿周围脑组织中促炎因子及M1型MG/MP水平升高,且M1型MG/MP的极化水平与脑出血后血肿周围水肿程度具有一致性。

采用流式细胞分选术区分中枢神经系统内小胶质细胞和浸润巨噬细胞

目的建立通过流式细胞分选术区分中枢神经系统内小胶质细胞和浸润巨噬细胞的方法。方法用成年C57BL/6小鼠建立双侧颈总动脉狭窄模型,分别采用集落刺激因子1受体抑制剂PLX5622或氯膦酸盐脂质体处理。将分离、匀浆、重悬后的小鼠脑和脊髓组织进行Percoll密度梯度离心,得到单核细胞悬液。采用CD45、CD11b和淋巴细胞抗原6家族成员C(Ly6C)抗体进行流式分选,获得小胶质细胞(CD11b^(+)CD45^(low)Ly6C^(-)细胞)和浸润巨噬细胞(CD11b^(+)CD45^(high)Ly6C^(+)细胞),并验证PLX5622和氯膦酸盐脂质体2种给药范式获得的处理效果。结果通过CD45、CD11b和Ly6C抗体可以有效区分中枢神经系统中小胶质细胞和浸润巨噬细胞。与对照组比较,PLX5622处理后小胶质细胞数量减少(P=0.001),而氯膦酸盐脂质体处理后浸润巨噬细胞数量减少(P<0.001)。结论所建立的流式细胞分选方法可有效区分中枢神经系统中小胶质细胞和浸润巨噬细胞,PLX5622和氯膦酸盐脂质体2种给药范式可分别选择性清除中枢神经系统内的小胶质细胞和浸润巨噬细胞。

黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

基于巨噬细胞自噬探讨畅脉乐胶囊对动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能影响的机制

目的基于巨噬细胞自噬探讨畅脉乐胶囊对动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能影响的机制。方法选取40只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(CO)组,模型(MO)组,低剂量畅脉乐胶囊(LC)组,高剂量畅脉乐胶囊(HC)组,每组10只,对MO、LC、HC组采用饲喂高脂饲料、维生素D3和尼古丁灌胃建立动脉粥样硬化大鼠模型,CO组不建立模。建模成功后,LC组灌胃5 mg/kg的畅脉乐胶囊,HC组灌胃15 mg/kg的畅脉乐胶囊,CO组、MO组同期给予灌胃同体积生理盐水,苏木素-伊红(HE)染色法检测主动脉组织病理形态,凝血检测仪检测血清凝血功能指标,油红O染色法检测巨噬细胞泡沫化情况;电镜观察巨噬细胞中脂滴及自噬体形成,免疫荧光法检测巨噬细胞中斑块稳定相关蛋白细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)及自噬相关蛋白螯合体(SQSTM)1、微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3的蛋白表达。结果CO组主动脉组织结构正常完整且排列整齐,内、中、外膜层清晰可见,分界清楚,可见数层弹力膜和平滑肌细胞,未见泡沫细胞及明显斑块形成;MO组主动脉结构紊乱,内膜可见明显增厚及脂质斑块弥漫,斑块内有大量泡沫细胞形成,并可见典型的不稳定斑块及大量炎性细胞浸润;与MO组比较,LC、HC组病理结构明显改善,主动脉可见典型的稳定斑块及较少的泡沫细胞,炎性细胞明显减少;与CO组比较,MO组血清中PT、INR、巨噬细胞中LC3显著降低(P<0.05),FIB、巨噬细胞中EMMPRIN及SQSTM1显著升高(P<0.05);与MO组比较,LC、HC组血清中PT、INR、巨噬细胞中LC3显著升高,FIB、巨噬细胞中EMMPRIN及SQSTM1明显降低(P<0.05),且HC组比LC组变化显著(P<0.05);CO组巨噬细胞染色较淡,未见巨噬细胞泡沫化及明显脂滴颗粒;MO组巨噬细胞被染成红色的区域数量明显增加,可见巨噬细胞出现泡沫化;与MO组比较,LC组、HC组脂滴数量明显减少,巨噬细胞泡沫化程度明显减轻;电镜结果显示,与CO组相比,MO组脂滴数量明显增多,自噬体数量明显减少;与MO组相比,LC组、HC组脂滴数量明显减少,自噬体数量明显增多,且HC组比LC组变化明显。结论畅脉乐胶囊可显著改善动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能,其作用机制可能与促进巨噬细胞自噬有关。

萝卜硫素通过调节ALOX5/NF-κB信号通路调控巨噬细胞糖酵解抑制糖尿病肾病进展

目的探讨萝卜硫素(SFN)调节花生四烯酸5-脂氧合酶基因(arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)/核因子kappa B(NF-κB)信号通路调节巨噬细胞糖酵解对糖尿病肾病(DN)进展的影响。方法生物信息学分析SFN治疗DN的靶基因。使用30 mmol/L高葡萄糖(HG)处理人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)诱导体外DN模型。将HK-2细胞分为如下组:正常糖(NG)组、HG组、HG+SFN(3 mmol/L)组、HG+ALOX5组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5组、HG处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+ALOX5转染处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5转染处理的巨噬细胞+HK-2细胞组。CCK-8检测细胞活力,原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;葡萄糖和乳酸试剂盒检测各组细胞中葡萄糖和乳酸水平;Western blot检测各组细胞中ALOX5、NF-κB以及糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达;使用链脲佐菌素(STZ)构建DN小鼠模型,DN小鼠给与SFN(0.5 mg/kg)治疗;检测小鼠各项生化指标,HE染色检测肾组织病理变化;Western blot检测小鼠肾脏巨噬细胞中糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达。结果生物信息学分析结果显示ALOX5是SFN治疗DN的靶基因。与HG组相比,SFN处理增强HK-2细胞活力并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,SFN处理抑制HG诱导的巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达,减弱巨噬细胞介导的HK-2细胞损伤(P<0.05);Western blot结果表明SFN抑制ALOX5和NF-κB的表达(P<0.05);小鼠实验结果显示,SFN治疗改善DN小鼠肾功能和肾组织病理学改变,抑制肾组织中巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达(P<0.05)。结论SFN通过抑制ALOX5/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞糖酵解从而改善DN进展。

巨噬细胞向肌成纤维细胞转化促进LPS诱导的急性肺损伤模型小鼠肺纤维化

目的探讨巨噬细胞向肌成纤维细胞转化(MMT)在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤小鼠肺纤维化过程中的作用。方法将21只小鼠分为7组:对照组、不同时间点LPS诱导小鼠早期肺纤维化(LPS-PF)模型组和不同时间点氯磷酸二钠脂质体(CL-LIP)干预组(n=3)。用HE、Masson染色评估各组肺纤维化程度;用免疫荧光检测MMT过程中CD68和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)共标记阳性细胞数量。骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)分为对照(Ctrl)组和转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激组(n=3);用RT-qPCR检测各组α-SMA、纤连蛋白(FN)、人I型胶原蛋白(Col1)表达水平。用Western blot检测各组间α-SMA以及Smad同源物3(Smad3)、磷酸化的Smad3(p-Smad3)蛋白表达量。结果LPS-PF模型小鼠肺组织第7天Ashcroft评分较对照(Ctrl)组显著增高(P<0.01);但在CL-LIP组中肺纤维化程度较LPS-PF组明显减轻(P<0.05)。肺组织免疫荧光染色发现,CL-LIP组CD68α-SMA共标记阳性细胞数较LPS-PF组对应时间点明显减少(P<0.01)。体外实验中,TGF-β1刺激组48 h、96 h后α-SMA、FN、Col1较对应时间点表达量明显增加(P<0.01)。检测体内、体外实验中Smad3、p-Smad3的蛋白表达量,发现LPS-PF组(第7天、第10天)和TGF-β1刺激组(48 h和96 h)均较各自对照(Ctrl)组明显增加(P<0.01)。结论MMT具有促进LPS诱导模型小鼠肺纤维化的作用,其转化过程可能经Smad3调节。

芪红散对巨噬细胞分化及炎症水平的影响

目的 研究芪红散对巨噬细胞分化及炎症水平的影响及其机制。方法 将单核细胞在PKC激活剂(PMA)的诱导下转化为巨噬细胞。仅使用PMA诱导的细胞定义为M0组,使用脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)诱导处理的细胞定义为M1组,在使用LPS和IFN-γ诱导处理的基础上加入低剂量以及高剂量芪红散进行干预的两组分别定义为M1+芪红散-L组以及M1+芪红散-H组。分别采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验(WB)检测4组细胞的增殖、凋亡、迁移情况和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、p50、p-p65水平。结果 与M0对比,M1组增殖、迁移、CD86^(+)分化比例、TNF-α、IL-6、p50及p-p65水平显著增加(P均<0.05),CD206^(+)分化比例、IL-10水平显著降低(P均<0.05)。与M1组比较,M1+芪红散-L组与M1+芪红散-H组CD86^(+)分化比例、TNF-α、IL-6表达水平均降低(P<0.05),且M1+芪红散-H组TNF-α及IL-6表达水平明显低于M1+芪红散-L组(P<0.05),IL-10表达水平明显高于M1+芪红散-L组(P<0.05)。与M1组比较,M1+芪红散-H组p50及p-p65表达水平均降低(P<0.05),M1+芪红散-L组206^(+)分化显著升高(P<0.05)。结论 芪红散可有效地减少巨噬细胞的CD86^(+)型分化,抑制炎症信号通路核因子-κB(Nuclearfactor kappaB,NF-κB)的激活从而降低炎症因子的表达,减轻炎症反应。

食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p通过靶向抑制PTEN促进肿瘤相关巨噬细胞极化

目的:探究食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p对M2型巨噬细胞极化的影响及机制。方法:提取并鉴定食管鳞状细胞癌外泌体,qRT-PCR检测miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞及其外泌体中的表达。M0型巨噬细胞分为PBS组、HEEC exo组、Eca-109 exo组、miR-NC exo组、miR-181b-5p exo组、miR-NC组、miR-181b-5p mimic组、si-NC组、si-PTEN组、miR-181b-5p exo+PTEN组,qRT-PCR检测各组细胞中CD163、CD206、iNOS、TNF-α表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p和PTEN的靶向关系。结果:miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞TE-13、TE-12、TE-10、Eca-109、KYSE30及其外泌体中显著高表达(P<0.001)。相比于miR-NC组,miR-181b-5p mimic组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示PTEN为miR-181b-5p的靶基因。相比于si-NC组,si-PTEN组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于PBS组,Eca-109 exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-NC exo组,miR-181b-5p exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-181b-5p exo组,miR-181b-5p exo+PTEN组CD163和CD206表达显著下调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.001)。结论:外泌体miR-181b-5p抑制PTEN表达而促进M2型巨噬细胞极化。

TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

低氧条件下食管癌来源外泌体调控巨噬细胞M2型分化与自噬的机制研究

目的:探究低氧条件下食管癌外泌体对巨噬细胞分化和自噬的影响及机制。方法:50 ng/ml PMA诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞,超速离心法提取并鉴定HEEC、Eca-109、缺氧诱导的Eca-109细胞分泌的外泌体(记为HEEC-exo、NomEca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo),激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对外泌体的摄取,将PBS、HEEC exo、Nom-Eca-109-exo、HypoEca-109-exo分别与M0型巨噬细胞共孵育,流式细胞术检测各组细胞CD14和CD206表达,ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10和TGF-β,qRT-PCR检测各组细胞CCR7、TLR2、CD206和CD14表达,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62表达及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平。结果:提取的外泌体符合结构和生物学特征。相比于PBS组,与Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo孵育后,各组M0型巨噬细胞CCR7、TLR2表达显著降低、CD206和CD14表达显著增加,IL-1β、IL-12、TNF-α分泌显著减少,Arg1、IL-10和TGF-β分泌显著增加,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,细胞迁移和侵袭数显著增加,PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平显著升高。相比于NomEca-109-exo组,Hypo-Eca-109-exo组细胞CD206和CD14表达显著增加,Arg1、IL-10和TGF-β分泌显著增加,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,细胞迁移和侵袭数显著增加,PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平显著升高。结论:低氧诱导的食管癌细胞外泌体可显著促进M2型巨噬细胞分化和自噬,进而促进肿瘤迁移和侵袭,其机制为激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。