迷走神经刺激通过调控M1/M2小胶质细胞极化减轻神经炎症改善癫痫大鼠认知功能

目的探讨迷走神经刺激(VNS)对难治性癫痫大鼠认知功能的影响及可能机制。方法通过腹腔注射氯化锂-皮罗卡品建立难治性癫痫大鼠模型。模型制作成功大鼠随机分为模型组(18只)与VNS组(15只),另外设对照组(20只)。对照组与模型组只分离迷走神经并植入刺激器,但不给予刺激;VNS组采取连续4周迷走神经电刺激。观察大鼠癫痫发作情况;Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能;Nissl染色观察大鼠海马组织病理形态;ELISA检测大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6和IL-10表达;免疫荧光染色法与Western-blot分别检测大鼠海马组织M1型小胶质细胞标记物(iNOS)和M2型小胶质细胞标记物(Arg1)相对表达。结果①与对照组相比,模型组大鼠癫痫发作等级及发作持续时间明显增加(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,大鼠癫痫发作等级及发作持续时间明显降低(P<0.05)。②模型组大鼠逃避潜伏期时间明显长于对照组,而穿越原平台的次数明显少于对照组(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,癫痫大鼠逃避潜伏期时间明显缩短,而穿越原平台的次数明显增加(P<0.05)。③对照组大鼠海马神经元形态正常;模型组大鼠海马神经元损伤严重,数量明显减少(P<0.05);VNS组大鼠海马神经元损伤相比模型组明显减轻,数量明显增加(P<0.05)。④模型组大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6相对表达明显高于对照组,而IL-10相对表达明显降低(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,癫痫大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6相对表达明显降低,而IL-10相对表达明显增加(P<0.05)。⑤与对照组相比,模型组大鼠海马组织iNOS相对表达明显增加,而Arg1相对表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,VNS组大鼠海马组织iNOS相对表达明显减少,而Arg1相对表达明显增加(P<0.05)。结论VNS具有改善难治性癫痫大鼠认知功能障碍的作用,其机制可能是通过促进M2型小胶质细胞极化,减轻中枢炎性反应,保护海马神经元。

从RORα调控的小胶质细胞M1/M2表型转换的角度探讨脑梗死发生的分子生物学机制

目的研究维甲酸相关孤核受体α(RORα)调控小胶质细胞M1/M2表型转换在脑梗死发病中的作用机制。方法①定向诱导原代小胶质细胞向M1/M2型转化,Western blot检测细胞内RORα及M1标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、M2标记物精氨酸酶1(Arg-1)的表达。②建立大脑中动脉栓塞(MCAO)小鼠模型,Western blot检测各个时间点(6 h、24 h、3天和7天)脑组织中iNOS、Arg-1、RORα的表达。③小鼠侧脑室注射RORα-siRNA,72 h后构建MCAO模型,缺血再灌注后3天,神经行为学评分(Longa评分)对脑功能进行评估,取脑组织,Western blot检测脑组织中iNOS、Arg-1、RORα的表达。④侧脑室注射RORα过表达慢病毒,于7天后构建MCAO模型,缺血再灌注后3天,神经行为学评分(Longa评分)评估小鼠脑功能。结果脂多糖/γ干扰素(LPS/IFN-γ)可诱导小胶质细胞向M1型转化,白细胞介素4/白细胞介素13(IL-4/IL-13)可诱导小胶质细胞向M2型转化,与对照组比较,RORα在M2型小胶质细胞中表达显著升高,在M1型小胶质细胞表达显著降低(P<0.01)。脑缺血再灌注后,与假手术组比较,iNOS在6 h明显升高并达到高峰,随后表达逐渐下降,Arg-1在3天、7天逐渐升高,RORα在脑缺血再灌注后3天达到最高,7天时明显降低,说明脑缺血损伤后早期以M1型小胶质细胞为主,脑缺血损伤晚期以M2型小胶质细胞为主,RORα在脑缺血损伤中期即M1/M2型小胶质细胞共存期呈现高表达。下调RORα表达后,MCAO小鼠神经行为学评分显著升高,脑功能损伤较为严重。下调RORα后,Arg-1、RORα蛋白表达量显著下降,而iNOS蛋白表达明显增加;上调RORα表达后MCAO小鼠神经行为学评分明显下降,脑功能损伤得到改善;过表达RORα后,Arg-1的表达量显著升高,而iNOS的表达明显较少。结论 RORα可通过调控小胶质细胞由M2型向M1转化参与脑梗死后脑损伤机制。

腺苷预处理对脑缺血再灌注大鼠小胶质细胞极化及神经损伤的影响

目的探讨大鼠脑缺血再灌注(IR)损伤后小胶质细胞表型的变化以及腺苷对脑IR损伤大鼠的神经损伤的作用。方法将36只健康雄性Sprague Dawley大鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、IR组和腺苷预处理(AP)组,每组12只。AP组大鼠造模前每天腹腔注射2 mL腺苷注射液,连续3 d;Sham组及IR组大鼠每天腹腔注射2 mL生理盐水,连续3 d。IR组和AP组大鼠采用线栓法构建大脑中动脉栓塞模型;Sham组大鼠仅分离颈动脉,不结扎血管。造模2 h后,采用5分制神经行为学评分对各组大鼠进行神经行为学评估。恢复大脑中动脉血流灌注24 h后处死各组大鼠,取出脑组织,采用苏木精-伊红(HE)染色观察缺血半暗带区域脑组织形态学改变,免疫荧光染色法检测M1型小胶质细胞标志物和M2型小胶质细胞标志物的共表达情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测2组大鼠脑组织中M1型小胶质细胞释放的促炎因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和M2型小胶质细胞释放的抗炎因子IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的相对表达量。结果IR组及AP组大鼠神经行为学评分显著高于Sham组,IR组大鼠神经行为学评分显著高于AP组(P<0.05)。HE染色结果显示,Sham组大鼠脑组织中细胞结构完整,细胞核清晰可见,细胞排列紧密,无间质水肿;IR组大鼠脑组织中细胞结构明显破坏,细胞排列不整齐,间质疏松,胞体内出现空泡;AP组大鼠脑组织中细胞结构较IR组完整,正常细胞数量较多,排列较整齐,细胞核较完整。免疫荧光染色结果显示,IR组、AP组大鼠脑缺血半暗带区域M1型、M2型小胶质细胞数量显著高于Sham组,IR组大鼠M1型小胶质细胞数量显著高于AP组,M2型小胶质细胞数显著低于AP组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,IR组、AP组大鼠脑组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、iNOS和抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β相对表达量显著高于Sham组(P<0.05);AP组大鼠中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、iNOS相对表达量显著低于IR组(P<0.05),抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β相对表达量显著高于IR组(P<0.05)。结论AP可促进大鼠脑IR损伤后小胶质细胞由M1型极化为M2型,抑制促炎因子的释放,增加抗炎因子的释放,对脑IR损伤大鼠具有神经保护作用。

小胶质细胞M1型/M2型与创伤后癫痫的关系研究进展

创伤后癫痫是脑创伤后的严重并发症之一,是一种致死、致残率较高的神经系统疾病。目前创伤后癫痫形成的确切分子细胞学机制仍不清楚。该文就创伤后癫痫与小胶质细胞M1型/M2型的关系进行综述,探讨是否存在被忽略的对创伤后癫痫形成有促进作用的可干预的机制。

激活α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)增加小鼠海马组织M2型小胶质细胞数量并减轻脓毒症脑病

目的检测α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)对M2型小胶质细胞的影响,探索其减轻脓毒症脑病(SAE)的机制。方法采用盲肠结扎穿刺术(CLP)于2月龄雄性C57BL/6小鼠构建SAE模型,比较两组小鼠学习记忆能力的改变。采用Western blot法检测海马组织中α7nAchR的表达变化。给予腹腔注射α7nAchR的激动剂二甲氧基苯亚胺基假木贼碱(GTS-21),观察给予激动剂后海马组织中α7nAchR的表达变化,同时探索GTS-21是否能减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。通过免疫荧光细胞化学染色法检测精氨酸酶1(ARG1)、离子钙结合接头蛋白1(Iba-1)的表达确定SAE小鼠M2型小胶质细胞数量的变化,以及GTS-21对M2型小胶质细胞数量的影响。结果SAE小鼠的新物体识别及恐惧记忆能力显著下降,小鼠海马组织中α7nAchR表达显著降低。GTS-21可改善SAE小鼠的学习记忆障碍,增加脑组织中α7nAchR的表达。同时,脓毒症小鼠海马组织中M2型小胶质细胞显著减少,而GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞的数量。结论SAE小鼠海马组织中α7nAchR表达降低,使抑制炎症反应的M2型小胶质细胞减少,GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞数量,减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。

脓毒症相关性脑病雄性小鼠学习记忆障碍与海马区α7nAChR表达及M1/M2型小胶质细胞比例有关

目的 探索脓毒症相关性脑病(SAE)雌雄小鼠认知差异及其内在机制。方法 6~8周龄雌雄小鼠分别进行盲肠结扎穿刺术(CLP)诱导SAE模型,通过新物体识别和恐惧记忆实验检测小鼠学习记忆功能。采用免疫荧光组织化学染色法检测SAE雌雄小鼠海马区域α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAChR)表达和分布,M2型小胶质细胞比例,Western blot法检测α7nAChR蛋白水平。结果 SAE雄性小鼠学习记忆功能较SAE雌性小鼠明显降低,且SAE雄性小鼠海马区域α7nAChR蛋白表达水平较SAE雌性小鼠显著下降。同时海马区SAE雄性小鼠M2型小胶质细胞所占比例较雌性小鼠明显降低。结论 SAE雄性小鼠海马区域α7nAChR蛋白表达水平较SAE雌性小鼠显著下降,且M2型小胶质细胞比例相对降低,导致SAE雄性小鼠学习记忆功能障碍的发生。

M2型小胶质细胞移植促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究

目的探讨M2型小胶质细胞(M2 microglia,M2-MG)移植促进小鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)修复的效果。方法取15只新生2~3 d C57BL/6乳鼠大脑皮质,通过胰蛋白酶消化法分离原代细胞并进行Iba1免疫荧光染色鉴定为MG后,以IL-4极化诱导培养48 h(实验组),通过精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)、Iba1免疫荧光染色鉴定其是否极化为M2-MG;以正常培养MG作为对照组。另取5只新生1周C57BL/6乳鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)与M2-MG共培养5 d,观测轴突长度;以单纯DRG作为对照。取42只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=6)、SCI组(n=18)及SCI+M2-MG组(n=18)。手术暴露脊柱T10节段后,假手术组仅切除椎板,SCI组及SCI+M2-MG组行SCI造模后,SCI+M2-MG组同时注射M2-MG。术后观测各组小鼠存活情况,并于术后当天(0)、3、7、14、21、28 d采用BMS(Basso Mouse Scale)评分评价小鼠运动功能恢复情况,28 d行足迹实验评价小鼠步态。术后取SCI组及SCI+M2-MG组脊髓组织行免疫荧光染色,其中7、14、28 d胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)染色观测SCI损伤区域面积,28 d神经元核抗原染色观察神经元存活情况,7、14 d GFAP/C3双重荧光染色观察表示A1星形胶质细胞数量变化。结果免疫荧光染色鉴定体外培养细胞为MG且纯度可达90%,经IL-4诱导培养后Arg-1免疫荧光染色示极化为M2表型。M2-MG与DRGs体外共培养5 d后可促进轴突生长(P<0.05)。动物实验示,术后各组小鼠均存活至实验完成。SCI组及SCI+M2-MG组小鼠术后后肢运动功能随时间延长逐渐恢复,其中21、28 d SCI+M2-MG组BMS评分较SCI组更高(P<0.05),28 d时拖曳步态明显减轻,但尚未达假手术组水平。免疫荧光染色示,与SCI组相比,SCI+M2-MG组在7、14、28 d损伤区域面积均缩小,28 d时存活神经元数量增加,7、14 d时A1星形胶质细胞减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论M2-MG移植可促进小鼠SCI神经元存活和轴突再生,改善小鼠后肢运动功能,分析这种神经保护作用与A1星形胶质细胞极化被抑制有关。

小胶质细胞极化在视网膜退行性疾病发病过程中的作用研究进展

小胶质细胞参与视网膜退行性疾病的发生和发展,小胶质细胞的激活是视网膜退行性疾病发生的共同标志。小胶质细胞可以被不同的外部刺激因素激活,细胞极化为功能状态和表面标志物不同的两种表型。经典激活途径产生M1型小胶质细胞,主要发挥促炎和神经毒性作用;选择性激活途径产生M2型小胶质细胞,主要发挥抗炎及神经保护作用。精准地调控小胶质细胞的极化是治疗视网膜退行性疾病极具潜力的方法。本文对小胶质细胞极化在视网膜退行性疾病发病过程中的作用进行综述,旨在为视网膜退行性疾病的治疗开辟新的途径和研究思路。

米诺环素介导小胶质细胞形态转换减轻缺血性脑卒中早期脑损伤的机制研究

目的观察大鼠缺血性脑损伤早期的病理生理特点,探讨米诺环素在缺血性脑损伤早期的神经保护效应及可能机制。方法线栓法制备大鼠缺血性脑损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在MCAO 6、24 h分别给予米诺环素腹腔注射,通过TTC染色观察脑梗死面积,TUNEL染色及尼氏染色检测神经元凋亡情况;免疫荧光染色了解小胶质细胞形态变化以及Western blot检测凋亡通路NF-κB表达情况。使用Morris水迷宫检测手术28 d后大鼠学习记忆能力。结果米诺环素减少MCAO 6 h后大鼠脑梗死面积[(43.0±5.3)cm^3vs(36.0±6.8)cm^3,P<0.01],减少脑神经元凋亡数量并促进M2型(神经保护型)小胶质细胞增殖,MCAO 24 h后米诺环素治疗不能改善脑梗死以及神经元细胞凋亡(P>0.05)。米诺环素显著减少MCAO 6 h诱导的凋亡信号通路蛋白NF-κB的表达(P<0.01)。MCAO 28 d后大鼠学习记忆能力较假手术组显著降低;米诺环素显著改善MCAO后学习记忆能力(P<0.05),而MCAO 24 h后米诺环素不能改善大鼠神经功能障碍,差异无统计学意义(P>0.05)。结论米诺环素能促进缺血性脑卒中早期活化小胶质细胞向M2型转化并抑制凋亡信号通路,减轻脑缺血诱导的神经炎症及细胞凋亡,改善大鼠学习记忆功能。

电针曲池、足三里对缺血再灌注大鼠缺血侧运动皮层小胶质细胞与外泌体蛋白的影响及机制

目的:探究缺血再灌注损伤大鼠缺血侧运动皮层中M2型小胶质细胞衍生的外泌体表达,观察电针曲池、足三里穴对缺血再灌注损伤大鼠运动功能的影响及其可能机制。方法:36只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组各12只,采用Zea-Longa神经行为学评分进行神经功能缺损评定;Catwalk跑台实验评估运动功能;免疫组化法标记缺血侧运动皮层M2型小胶质细胞阳性细胞数量,免疫荧光双标法标记其外泌体蛋白CD81的表达。结果:干预7d后,电针组与模型组大鼠相比,Zea-Longa评分显著降低(P<0.05);步行速度增快(P<0.01),持续时间减少(P<0.05),大鼠爪印面积显著性增加(P<0.01);缺血侧运动皮层M2型小胶质细胞及其分泌的外泌体蛋白CD81增多,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:电针曲池、足三里穴可促进缺血侧运动皮层M2型小胶质细胞外泌体的分泌,发挥神经保护作用,有效改善缺血再灌注损伤大鼠的运动功能。

xCT和促血管生成因子在胶质瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的表达及意义

目的:探讨xCT和促血管生成因子在胶质瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的表达,以及TAMs对胶质瘤进展的影响。方法:分离并培养人新鲜胶质瘤和正常脑组织中的TAMs。采用荧光实时定量(RT-PCR)技术检测M2表型标记物CD14和CD86,促血管生成因子Arg-1和CD209,以及xCT mRNA表达水平。组织冰冻切片免疫荧光染色检测CD68和xCT在胶质瘤中的表达。结果:xCT和CD68在胶质母细胞瘤(WHO°Ⅳ)中的表达明显高于WHO°Ⅱ胶质瘤和正常脑组织,且xCT和CD68共同表达于小胶质细胞中。xCT mRNA在分化程度差的胶质瘤中表达明显增高。此外,小胶质细胞M2表型标记物表达水平(CD14和CD86)、活化状态的TAMs数目和促血管生成因子(Arg-1和CD209)与肿瘤分级相关。结论:TAMs能够通过xCT过表达,促炎症因子和促血管生成因子促进胶质瘤的发展。肿瘤中M2表型的TAMs募集与脑胶质瘤的不良预后相关。

电针对阿尔兹海默病大鼠海马区M2型小胶质细胞极化的影响

目的:探讨促进海马小胶质细胞向M2极化是否为电针治疗阿尔兹海默病(AD)的作用机制。方法:通过侧脑室注射Aβ制作老年痴呆大鼠模型,采用形态学和分子学方法,研究电针治疗AD调控小胶质细胞极化的机制。结果:电针能降低AD模型大鼠Aβ的沉积,促进大鼠海马区M2型小胶质细胞(Iba1+Arg1+)的生成(P<0.01),抑制M1型小胶质细胞(Iba1+i NOS+)的生成(P<0.01),促进大鼠海马组织Arg1蛋白的表达(P<0.01),抑制i NOS蛋白的表达(P<0.01),抑制大鼠海马组织细胞因子IL-1β和TNF-αm RNA的表达(P<0.01)。结论:电针百会穴可调控大鼠海马区小胶质细胞极化状态,促进小胶质细胞向M2型方向极化,抑制M1型小胶质细胞的生成,起到改善大鼠AD病变的效果。

MPTP诱导的慢性帕金森病小鼠模型肠道菌群及脑内炎症情况

目的探讨慢性帕金森病(PD)小鼠模型肠道菌群构成、肠道炎症及脑内黑质区炎症情况。方法取SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机分为对照组、PD模型组。采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致慢性PD模型。通过爬杆实验、转棒实验进行行为学检测,采用16SrDNA技术、苏木素-伊红(HE)染色、免疫荧光染色、Western印迹法、实时定量PCR法检测小鼠肠道菌群、盲肠炎症、黑质区小胶质细胞及炎症因子情况。结果与对照组相比,PD模型组爬杆实验、转棒实验时间明显延长(P<0.01);PD模型组肠道菌群α多样性显著高于对照组(P<0.05),OTUs聚类、肠道菌群门属水平比较提示PD模型组肠道菌群组成结构改变;PD模型组小鼠盲肠黏膜HE染色发现黏膜下炎症细胞浸润;PD模型组小鼠黑质TH表达明显下调(P<0.01),Iba-1、iNOS、Arginase表达上升,M1型与M2型小胶质细胞比值远大于1(P<0.01),炎症因子白细胞介素(IL)-1β明显升高(P<0.01),IL-10明显下降(P<0.05)。结论MPTP致慢性PD小鼠模型出现肠道菌群变化、肠道炎症及黑质小胶质细胞M1型极化,炎症因子分泌增加,肠道菌群可能通过调节肠道及脑内黑质区炎症影响PD。