小西葫芦绿斑驳花叶病毒生物学特性及传播方式

小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV)是我国新报道的侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒。从感染病毒的葫芦叶片中分离出ZGMMV,摩擦接种西瓜(Citrullus lanatus)、葫芦(Lagenaria siceraria)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、丝瓜(Luffa cylindrica)、黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、西方烟(Nicotiana occidentalis)、本生烟(Nicotiana benthamiana)和心叶烟(Nicotiana glutinosa),通过症状观察、血清学和分子生物学检测明确症状特点和寄主范围;研究病毒的种子传播,以及整枝打杈和滴灌对于病毒的传播。结果表明:ZGMMV可侵染所有供试植物;叶片症状主要为花叶、斑驳和褪绿斑,西瓜茎蔓出现坏死斑、果实倒瓤,甜瓜果实表皮出现褪绿斑;ZGMMV可通过整枝打杈等农事操作机械传播,也可通过滴灌的水在土壤中传播。该病毒在西瓜、葫芦和甜瓜上可以种传,种传率均约为1%。研究结果有助于制订该病害的综合防控策略。

喷施3种商品化纳米颗粒对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防效初探

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属我国进境检疫性有害生物,主要危害西瓜、甜瓜、瓠瓜等葫芦科作物,给瓜类生产造成严重的经济损失。本研究通过在西瓜叶面喷施商品化的纳米氧化锌(ZnO NPs)、纳米二氧化钛(TiO_(2)NPs)、纳米二氧化硅(SiO_(2)NPs),以评价3种纳米颗粒对感染CGMMV的西瓜植株生物量、叶绿素含量以及病毒积累量的影响。试验结果表明,经TiO_(2)NPs和SiO_(2)NPs预处理的感染CGMMV的西瓜植株的生物量与叶绿素含量均显著高于对照,TiO_(2)NPs、SiO_(2)NPs和ZnO NPs处理组的CGMMV外壳蛋白积累量显著低于对照组,而ZnO NPs处理组的植株生物量、叶绿素含量与对照组无明显差异,各处理组植株的株高与对照组无显著差异。本研究为黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防控提供了新的思路,对于后续利用纳米材料辅助抗CGMMV具有一定的参考意义。

转录因子NbERF RAP2-1在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染中的功能

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国重要的检疫性植物病毒,对蔬菜和瓜类产业造成严重的经济损失。ERF转录因子可以调控植物生物和非生物胁迫,参与植物对多种病害的防御作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著下调寄主转录因子Nb ERF RAP2-1的表达。【目的】明确ERF转录因子家族成员在CGMMV侵染过程中的作用,为CGMMV病害防治提供理论依据。【方法】运用MEGA7.0构建系统进化树,对基于Nb ERF RAP2-1蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析;构建Nb ERF RAP2-1的荧光表达载体,并观察其亚细胞定位;利用q RT-PCR技术分析Nb ERF RAP2-1在CGMMV侵染不同时期的表达量;通过烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)和瞬时过表达Nb ERF RAP2-1分析其在CGMMV侵染过程中的作用。【结果】系统进化树分析表明,Nb ERF RAP2-1与多种烟草的ERF转录因子同源性极高,与拟南芥的ERF转录因子亲缘关系较远;亚细胞定位结果显示Nb ERF RAP2-1定位于细胞核,作为转录因子行驶功能;CGMMV侵染对本氏烟内源基因Nb ERF RAP2-1的转录水平影响结果显示,在CGMMV侵染6、9、12 d时Nb ERF RAP2-1的表达量无明显变化,在CGMMV侵染15和18 d时Nb ERF RAP2-1表达量显著下调;TRV介导的VIGS可以将植物内源基因Nb ERF RAP2-1有效沉默,在沉默的植株系统叶上接种CGMMV,8 d对照植株系统叶出现斑驳、卷曲症状而Nb ERF RAP2-1沉默植株无症状,同时CGMMV RNA水平和蛋白水平检测结果也表明TRV:Nb ERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV的积累;同样,分别在本氏烟叶片瞬时过表达Nb ERF RAP2-124、48和72 h时检测CGMMV RNA水平和蛋白水平表达量,结果显示在病毒侵染早期,即复制阶段就抑制CGMMV的表达。【结论】Nb ERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒复制,即病毒RNA复制阶段;随着CGMMV不断侵染,在CGMMV细胞间运动和系统运动时期,CGMMV识别防御相关基因Nb ERF RAP2-1并抑制该基因的转录;当Nb ERF RAP2-1缺失后可能抑制了下游蛋白的转录或表达,从而抑制病毒侵染后期的积累。由此可见,Nb ERF RAP2-1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定

从广西南宁市郊温室大棚中的葫芦[Lagenaria siceraria(Molina)Stand.]上采集到一个表现脉绿、花叶症状的病毒样品,ELISA检测表明,该样品与黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)有密切的血清学关系,利用RT-PCR方法从样品中扩增获得约500bp的DNA片段,序列分析表明,该片段是CGMMV的外壳蛋白基因,暂将该病毒分离物定名为GX-BG。外壳蛋白基因核苷酸序列系统进化树分析表明,已报道的CGMMV主要分为3大群体,GX-BG与中国辽宁分离物(CGMMV-LN)分别属于不同的群体。

干热处理对葫芦科种子质量的影响及对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治效果

以葫芦和南瓜种子为材料,比较了68、72、75、80℃4个干热处理温度条件及6℃和常温2种种子保存条件对种子质量的影响;通过田间栽培试验检测了种子干热处理对黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的防治效果。结果表明:68~80℃的温度处理种子72 h后,不会影响葫芦种子的发芽势和发芽率,但显著降低了南瓜种子的发芽势和发芽率。高温干热处理后,3个葫芦品种的种子分别在常温和6℃下保存15个月后,种子发芽势均显著下降;2个南瓜品种分别在常温和6℃下保存12个月后,除68℃和72℃处理的南瓜京欣砧2常温保存种子的发芽势以外,其他处理种子的发芽势和发芽率都显著下降。通过3 a 3种不同栽培模式的田间试验,不同带毒率的葫芦砧木种子经过72℃干热处理72 h后,嫁接西瓜在田间均未发生CGMMV。试验结果表明,不同葫芦科作物种类,甚至不同品种对温度的敏感性不一样;干热处理种子是防治CGMMV最有效的方法之一。

葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的葫芦植株上收取种子,通过苗期症状观察法、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、免疫捕获反转录PCR(IC-RT-PCR)法测定葫芦种子的带毒情况,并用生物学接种方法测定葫芦种子携带病毒的侵染活性。苗期症状观察法结果表明,199株幼苗有2株表现花叶斑驳症状,种子传毒率为1.01%;而利用DAS-ELISA和IC-RT-PCR法随机检测30粒葫芦病株种子,CGMMV检出率为100%。种子各部位携带的CGMMV接种葫芦表现典型的花叶斑驳症状,表明葫芦种子携带的CGMMV具有侵染活性。DAS-ELISA检测葫芦种子CGMMV的灵敏度为1/5120种子研磨液。

3种葫芦科作物种质资源中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

为确定黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦、西瓜、甜瓜3种葫芦科(Cucurbitaceae)作物种质中的携带部位、最低检测量及不同检测技术的检测效果,对3种作物的不同种质资源以及同种种质资源的不同处理进行了DAS-ELISA和RT-PCR检测,结果显示受侵染葫芦种子的种皮、种仁可带毒;受侵染西瓜的瓜叶、瓜皮、瓜瓤、种皮、种仁、瓜蔓均可带毒;受侵染甜瓜的叶片可带毒。RT-PCR检测灵敏度高于ELISA。

种子粉基体黄瓜绿斑驳花叶病毒标准样品研制及应用

基于国内黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)标准样品缺失的问题,以自然感染CGMMV的西葫芦种子批为原料,经特异性鉴定确认后,制备了西葫芦种子粉基体CGMMV标准样品,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法和实时荧光定量RT-PCR法对其进行确证。结果表明所制备的标准样品性能稳定,经国内8家实验室对样品进行协同定值后,再经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布。此外,采用Grubb’s法检验进一步证实该种子粉基体标准样品中含有CGMMV。以上结果表明,该基体标准样品达到了国家标准样品的技术要求,或可用于实验室质量控制及能力验证、检测方法验证等活动。

黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV及葫芦科作物抗性遗传改良研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是侵染葫芦科作物的重要病毒之一,对葫芦科作物的生产造成了严重威胁。本文对CGMMV的分布和分类,全基因组序列、进化关系及结构,CGMMV的检测方法,以及葫芦科CGMMV抗性的遗传分析及遗传改良包括抗性材料的筛选及种间杂交、基于基因工程的遗传改良、mi RNAs测序及人工mi RNAs等方面的研究进展进行综述。另外,对葫芦科作物CGMMV抗性遗传改良中存在的问题及应对策略进行了探讨和展望。

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列,筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法(加SYTO-9)和可视化方法(加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明,优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10^(3) fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析,表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0(1~1,95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择,对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。

黄瓜绿斑驳花叶病毒综合防治研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒,是我国的检疫性有害生物,在我国多个省、区、市均有发生,对葫芦科作物的生产造成了严重的威胁,引发了严重的经济损失。黄瓜绿斑驳花叶病毒是直形棒状结构的病毒粒子,主要通过种子、嫁接、介体传播。目前,通常采用生物、化学、物理防治等手段进行防治,但效果并不佳。随着生物科学技术的发展,CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术为植物病毒病的防治提供了有效的途径,CRISPR/Cas9能够准确地定位植物体内的目的基因,通过定点编辑目的基因,获得抗病基因,以达到植物实现抗病的目的。这一途径对黄瓜绿斑驳花叶病毒的有效防治提供了可能。

砧木葫芦制种中的黄瓜绿斑驳花叶病毒病预防技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlenlosaicvims，CGMMV）主要危害黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦等葫芦科作物，是全国农业植物检疫性有害生物之一。该病毒主要通过带毒种子远距离传播和授粉、嫁接等农事操作造成田间传播．病害造成果实的商品性下降．尤其在西瓜上引起倒瓤、水浸瓜等．造成毁灭性损失。随着近年来西瓜种植的规模化和嫁接育苗技术的普及．

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1-3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301-6 423 nt,扩增引物序列为F:GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R:GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶(61-3 495 nt)、186K复制相关蛋白(61-5 007 nt)、运动蛋白MP(4 994-5 788 nt)和外壳蛋白CP(5 763-6 248 nt)。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物(GenBank登录号:KY753928)同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率

【目的】加强种子带毒检测,防止黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)通过种子传播而导致该病害的扩散和流行。【方法】以感染CGMMV的西瓜、甜瓜病株收获的种子为材料,应用DAS-ELISA检测感染CGMMV的种子带毒率和传毒率。【结果】250粒西瓜种子全部为阳性,带毒率达100%;623株西瓜幼苗14株为阳性,传毒率为2.25%。130粒甜瓜种子122粒为阳性,带毒率达93.85%;2 050株甜瓜幼苗58株为阳性,传毒率为2.83%。灵敏度检测种子带毒量在感染种子研磨样体积与健康种子研磨样体积为1/1 000时仍检测是阳性;叶片带毒量在病叶研磨样体积与健康叶研磨样体积为1/10 000时仍检测是阳性。【结论】感染CGMMV西瓜、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主。灵敏度检测表明DAS-ELISA能进行大批量的种子检测。

检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防疫控制

综述了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus)的分布、识别特征、生物学特性、传播方式,及其检测技术和风险分析,并提出了相关防疫措施。

黄瓜绿斑驳花叶病毒生物学特性及对西瓜生长的影响

对黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)在辽宁省的分布、生物学特性及病毒侵染对西瓜产量和品质的影响进行了研究。结果表明:CGMMV在辽宁省的营口、鞍山、沈阳、丹东、大连、辽阳等地均有分布;在供试的5科21种植物中,病毒仅可侵染葫芦科的西瓜、黄瓜、葫芦、南瓜、角瓜、甜瓜、瓠瓜7种植物,并表现系统花叶症状。该病毒致死温度95～100℃,稀释限点10-4～10-5,体外保毒期119d。电镜观察病毒粒子直棒状,长300nm,宽15nm。RT-PCR检测表明,盖州、台安、新民的西瓜花叶样品为黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜株系。利用春秋两季大棚栽培西瓜接种试验表明,西瓜感染CGMMV后,导致植株生长缓慢,结瓜稍小,自根西瓜产量减产幅度很大,秋季大棚减产38.7%～47.6%,春季大棚减产11.4%～19.4%;采用葫芦嫁接的西瓜产量损失变化较小,秋季大棚减产3.4%～17.5%,春季大棚减产2.5%～9.1%。另外,研究结果表明,CGMMV侵染直接导致西瓜倒瓤,使西瓜丧失食用价值,血清学检测倒瓤西瓜携带CGMMV。

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定

为确定从江苏省洪泽县大棚西瓜、仪征市露地瓠瓜、东台市露地南瓜上采集到3个表现为褪绿、斑驳花叶症状的病样是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)侵染,采用电子镜观察、RT-PCR和序列测定方法对其进行鉴定。电子显微镜下可见300 nm×18 nm大小的直杆状病毒粒子。根据已报道的CGMMV外壳蛋白质(cp)基因序列合成特异性引物,对所提取病样的总RNA进行RT-PCR扩增,3个分离物的RNA模板中均可扩增到大小为500 bp左右的DNA片段,测序结果表明3个分离物的片段均含有486个核苷酸,包含完整的cp基因,编码161个氨基酸。3个分离物与已报道的7个CGMMV分离物核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为91.8%～99.8%和98.1%～100.0%,与同属的其他3个病毒(Kyuri绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒和小西葫芦绿斑驳花叶病毒)cp基因核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为40.7%～54.7%和44.4%～60.2%,表明所采集的3个病样由CGMMV侵染引起。

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生和防治

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是2012年江苏新发生在葫芦科作物上的一种病毒病害,主要发生在大棚西瓜上,病源随西瓜种子或种苗调运进入江苏,目前在苏南、苏中、苏北等地均有发现。本文叙述了CGMMV的特点、分布、传播途径和危害规律,确定绿脉、斑驳为其特征性症状的简易识别方法和5月份前在大棚西瓜发生的花叶病毒病多数为CGMMV危害的辅助识别手段,提出目前江苏该病毒防治应在加强宣传培训的基础上采用"检、消、扑、治"的防治策略。

黄瓜绿斑驳花叶病毒海南分离物基因组测定与毒源分析

为分析2012年采自海南西瓜上具黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染典型症状的病毒分离物CGMMV-HaiN12的分子特征和可能来源，以病叶总RNA为模板，分3段进行RT-PCR扩增，测定了该分离物基因组全长序列。结果表明CGMMV-HaiN12基因组全长为6425 bp（GenBank登录号KC852074），与已报道的CGMMV分离物相比，除5′和3′端非编码区核苷酸数目略有不同外，编码区的基因结构完全相同。CGMMV-HaiN12全基因组序列与韩国分离物AF417242的相似性为99．6％、遗传距离为0．004，在进化树的末端两者聚为一支。将CGMMV-HaiN12与已发布的中日韩分离物的外壳蛋白基因序列进行遗传进化分析，所有分离物在0．000～0．027的遗传距离上聚为一支，显示这些分离物具有高度的相关性，而与欧洲的西班牙和俄罗斯的2个代表分离物具有较大差别。在进化树末端，CGMMV-HaiN12与3个韩国分离物（AJ245440、JF838188、AF417242）、2个我国湖南分离物（JQ715592、JQ715595）聚为一支，表明CGMMV-HaiN12可能由韩国传入，并且与传入我国湖南的分离物高度同源。在海南本地不进行西瓜制种的情况下，为控制CGMMV在海南的危害应加强对进入海南的西瓜和砧木种子的检疫工作。

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。