小麦—簇毛麦6VS/6AL易位材料幼胚一步成苗培养技术集成

基因型差异是影响小麦幼胚一步成苗培养的主要因素。比较了小麦—簇毛麦易位材料与扬麦5号和中国春的一步成苗培养的污染率、成苗率、再生植株生根培养效率等主要技术指标,建立了适用于小麦—簇毛麦易位材料幼胚的—步成苗培养的有效技术体系,为培养纯合的普通小麦—簇毛麦6VS/6AL,小片段易位体系提供了技术支持。

普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系抗病性在不同小麦遗传背景中的传递

小麦条锈病和小麦白粉病是中国小麦的两大病害 ,由南京农业大学细胞遗传研究所培育的小麦 簇毛麦 6VS/ 6AL易位系高抗白粉病 ,并对中国当前新优势条锈菌生理小种表现高抗。用 6VS/ 6AL易位系与中国不同小麦生产区的栽培品种宁春 4号、扬麦 5号、扬麦 15 8、申 32 10 9、豫麦 13、豫麦 18等进行杂交 ,对其杂种后代进行田间抗条锈病和抗白粉病鉴定。从各杂交组合中均选出对白粉病和条锈病高抗的单株和株系 ,其抗病性在小麦不同遗传背景中可以正常表达。对从F3 ～F8代中选出的抗病材料进行根尖染色体C 分带和分子原位杂交鉴定 ,在所鉴定的高抗单株和株系中均含有一对或一条 6VS/ 6AL易位染色体。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系叶片cDNA文库构建及鉴定

用表达型质粒载体pSPORT 1构建了经白粉菌 (Erysiphegraminis)诱导 48h和未经诱导的小麦 簇毛麦 6VS/ 6AL易位系(Triticumaestivum Haynaldiavillosatranslocationline)叶片cDNA文库各一个。文库宿主菌为E .coliDH10B。非诱导文库包含约 5 0万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段为 1 2 5kb ,主要分布在 40 0bp～ 2 2kb。诱导文库包含约 30万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段 1 2kb。用克隆的病程相关基因 (pathogenesisrelatedgene) 小麦类甜蛋白基因pWIR作探针 ,进行杂交筛库 ,杂交信号明显 。

普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系cyclophilin基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR的方法从普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系克隆到1个cyp基因，命名为Ta-Hv-cyp。该基因全长为599bp，编码1条171个氨基酸残基的多肽，具有保守的功能位点W128和胞质型CyP蛋白特有的插入序列KSGKPLH48-54。BLAST分析表明，推导的Ta-Hv-CyP蛋白分别与小麦、水稻、玉米、拟南芥的胞质型CyP具有98％，88％，85％和80％的氨基酸序列一致性。构建的进化树显示，推导的Ta-Hv-CyP蛋白与单子叶植物胞质型CyPs的亲缘关系较近。

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·6AL的选育

在小麦背景中离果山羊草3C染色体具有优先传递的作用。当离果山羊草3C染色体处于单体状态时会导致后代不含有杀配子染色体的配子中产生包括缺失和易位等染色体结构变异。簇毛麦4V染色体携有抗小麦眼斑病和全蚀病基因。为进一步利用簇毛麦4V染色体上的有益基因,利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系(DA4V)与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系(DA3C)杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T4VS·6AL。该易位系为杀配子染色体诱发形成的非补偿型易位;易位系T4VS·6AL高抗梭条花叶病,是小麦抗病育种的新种质。

利用染色体C-分带和双色荧光原位杂交技术鉴定普通小麦-黑麦-簇毛麦双重易位系1RS·1BL,6VS·6AL

为改进小麦－黑麦 １ＲＳ· １ＢＬ易位系的抗病性，丰富栽培小麦品种的遗传多样性，本文通过１ＲＳ·１ＢＬ与６ＶＳ·６ＡＬ易位系杂交，在后代中利用染色体ＣＷ带技术从杂种Ｆ２中鉴定出小麦－黑麦－簇毛麦双重易位纯合体 １ＲＳ· １ＢＬ，６ＶＳ· ６ＡＬ（２ｎ＝ ４２），ＰＭＣ ＭＩ染色体平均构型为１９．１４ ＋１．８６ ，表明该易位系具有良好的细胞学稳定性；利用生物素和地高辛分别标记的黑麦和簇毛麦基因组ＤＮＡ为探针进行双色荧光原位杂交，在ＲＴＣ和ＰＭＣ中均清晰地观察到呈黄绿色的黑麦染色质和呈红色的簇毛麦染色质，小麦染色质呈蓝色，进一步证实了Ｃ－分带结果。该易位系育性正常，并具有良好的农艺性状和白粉病抗性，是同时利用１ＲＳ·１ＢＬ和６ＶＳ·６ＡＬ易位染色体进行小麦品种改良和遗传研究的有用种质。

绵麦37及其衍生小麦品种(系)的6VS/6AL易位染色体结构演变

绵麦37是四川小麦育种的骨干亲本,含6VS/6AL易位染色体,高抗白粉病。为了明确6VS/6AL在其衍生品种中的传递情况,本研究利用寡核苷酸探针和ND-FISH技术对内麦8号、绵麦37的衍生品种(系)和部分相关亲本共17份材料进行了分析。结果表明,内麦8号、绵麦37及其9个衍生品种(系)都含有1对6VS/6AL易位染色体,其中内麦8号、绵麦37、绵麦51、绵麦285、绵麦1416、绵麦1419和绵麦1618的6AL长臂上带有寡核苷酸探针Oligo-713的信号,而其余4个衍生品种(系)的6VS/6AL染色体无该探针信号,说明绵麦37衍生品种(系)中的6VS/6AL染色体出现了新型结构变异。根据系谱和其他亲本的ND-FISH分析结果可以推测,这种结构变异是由6VS/6AL易位染色体与小麦6A染色体在长臂上发生重组交换引起的。

不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No.1026(Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。

含Pm21基因的次级易位创制及鉴定

小麦-簇毛麦6VS.6AL易位携带抗白粉病基因Pm21,对我国小麦抗白粉病育种做出了重要贡献。本文对162份四川小麦品种(系)的55KSNP芯片数据分析表明,25份含6VS.6AL易位染色体,占15.4%。重组位置和单倍型分析表明,这些材料的6VS.6AL均为着丝点易位、具有单一来源。根据系谱分析, 92R178为最原始的供体材料。利用由ph1b诱导6VS/6AS部分同源重组形成的,含Pm21基因的初级易位6VS-6AS.6AL和6AS-6VS.6AL为亲本,创制了1个含Pm21基因、6VS片段大幅减小的6AS-6VS-6AS.6AL次级易位。根据中国春参考基因组,该次级易位的2个重组位点,分别位于6A染色体53.1~53.8 Mb和90.7~92.2 Mb之间,易位片段大小在36.9~39.1 Mb之间。分子细胞学鉴定表明,ph1b诱导外源易位的同时,小麦自身的内源染色体也发生了大量易位,这影响易位系的遗传稳定和育种利用。为了解决这个问题,建议将ph1b基因突变系以杂合的形式进行长期保存。同时,在利用ph1b诱导小麦-外源易位的过程中,尽量减少ph1b纯合状态下的繁殖世代,以减少小麦内源染色体易位。育种利用时,应尽快消除小麦内源易位。

小麦中与白粉病抗性相关的两个新基因序列的克隆、特征分析及染色体定位(英文)

根据抗病基因保守结构域设计简并性引物 ,以被白粉菌 (Erysiphegraminis)诱导后的小麦_簇毛麦 6VS/ 6AL易位系和“扬麦 5号”cDNA为模板进行反转录PCR(Reverse_transcriptionPolymeraseChainReaction ,RT_PCR)筛选 ,从小麦 (TriticumaestivumLinn .)中分离到 2个cDNA片段。蛋白质一级结构分析表明 ,它们分别与植物中已分离的cy clophilin蛋白和H+ _ATP酶高度同源 ,将小麦中这 2个基因分别定名为 :Ta_Cyp和Ta_MAH。经Northern杂交分析表明 ,这 2个基因在抗病的小麦_簇毛麦 6VS/ 6AL易位系及感病“扬麦 5号”中的表达水平有一定差异 ,因此推断这 2个基因有可能与小麦_簇毛麦 6VS/ 6AL易位系的抗病性相关。Southern杂交发现Ta_Cyp基因在小麦基因组中的拷贝数为 2 - 3个 ,Ta_MAH为单拷贝。利用中国春缺体_四体系 ,已将Ta_Cyp基因定位在小麦 6A、6B及 6D染色体上。用Ta_Cyp作探针 ,Southern杂交显示在簇毛麦、硬粒小麦_簇毛麦双二倍体、小麦_簇毛麦 6VS/ 6AL易位系与“扬麦 5号”之间表现多态 ,表明小麦基因组和簇毛麦染色体 6VS上有其同源基因。

小麦Beclin1类似基因的分子克隆与鉴定(英文)

以小麦 簇毛麦 (Triticumaestivum Haynal diavillosa) 6VS/6AL易位系 92R1 3 7为材料 ,应用mRNA差异显示和快速扩增cDNA末端 (rapidam plificationofcDNAends,RACE)技术对在白粉菌(Blumeriagraminis)诱导后表达增强的基因进行了克隆。分离到一个与拟南芥Beclin1类似基因同源的全长cDNA克隆 ,暂定名为小麦Beclin1类似基因。它编码 441个氨基酸组成的多肽。二级结构推导显示与人类Beclin相似 ,具有螺旋结构。Northern杂交分析表明 ,小麦Beclin1类似基因在白粉菌诱导后表达增强。Southern分析证明 。

小麦抗病种质贵农775的细胞学分析

利用基因组原位杂交和C-带分析,对抗病种质贵农775进行细胞学观察.以地高辛(Digoxigenin-11-dUTP)标记的簇毛麦基因组DNA为探针的基因组原位杂交结果表明:贵农775的1对染色体短臂带有来自簇毛麦的遗传物质;C-带分析可知带有簇毛麦遗传物质的染色体为6VS/6AL的易位染色体.该研究首次报道了簇毛麦是贵农775形成过程中的原始亲本之一,贵农775的抗白粉病性与这对易位染色体有关.