抗黄矮病小麦易位系cDNA文库的构建

对小麦-中间偃麦草易位系HW642一周龄幼苗接种饲黄矮病毒蚜虫,接种48 h后取幼叶提取mRNA构建了一个cDNA文库,文库的滴度为1.5×105pru/mL.随机挑取103个重组克隆,用限制内切酶EcoR I、Xho I消化,统计分析结果表明插入片段在150～4000 bp之间,平均插入片段大小为2000 bp左右,重组率为95.15 ％.文库可用于筛选抗病候选基因及EST研究等.

小麦-大赖草易位系对赤霉病抗性的聚合

利用C-分带、FISH、SSR技术，从小麦-大赖草易位系T01～T14中筛选出8个纯合易位系。将不同易位系相互进行杂交，配制了11个杂交组合，并对各易位系及其杂种后代进行赤霉病抗性鉴定。结果表明，大赖草各易位系对赤霉病的抗性接近于苏麦3号，但不同地点及年份间差异较大。涉及不同大赖草染色体的易位系间的杂种F1与其抗性较高的易位系亲本相比抗性有所提高，但涉及大赖草Lr．7或5Lr#1同一条染色体的不同易住系间杂种F1的抗性仅位于两亲本之间。这表明位于不同大赖草染色体上的抗赤霉病基因具有累加效应，通过不同大赖草染色体易位系的聚合，可提高赤霉病的抗性。

ω-黑麦碱基因沉默对小麦1B/1R易位系加工品质的影响

ω-黑麦碱是造成小麦1B/1R易位系加工品质差的一个重要因素,为探索解决这一问题,构建了ω-黑麦碱基因沉默表达载体,并通过农杆菌介导转化小麦品种金禾9123,获得3个T_0代转基因植株,再经连续的扩繁和PCR检测,获得纯合转基因T_4代株系。酸性PAGE检测结果表明,这些纯合转基因株系中ω-黑麦碱的总表达量平均下降53%。这些ω-黑麦碱基因沉默的转基因株系的面筋指数、沉降值和稳定时间均显著提高,而其农艺性状,如株高、穗粒数、千粒重和小区产量,均没有受到不良影响,说明沉默ω-黑麦碱基因可以在不影响产量的前提下提高小麦1B/1R易位系的加工品质。

小麦-簇毛麦易位系的抗条锈性遗传分析

本文对7个小麦-簇毛麦易位系种质V9128-1、V9128-3、V9129-1、V3、V4、V5、V12的抗条锈性进行遗传研究。用小麦条锈菌对供试材料苗期接种鉴定表明,7个易位系的抗病谱存在着明显的差异,据基因推导原理和系谱分析,可初步推测这7个易位系所包含的抗条锈基因不尽相同。进而对两个抗病谱较宽的易位系的抗条锈性进行了遗传分析。结果表明:小麦-簇毛麦易位系V9128-1对条锈菌CY30的抗条锈性由一对显性基因控制,小麦-簇毛麦易位系V3对条锈菌CY31的抗条锈基因由一显一隐2对基因控制。揭示了小麦-簇毛麦易位系抗条锈性为寡基因控制,为尽快利用这些宝贵抗病基因,培育小麦抗锈品种提供了科学依据。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

普通小麦-柔软滨麦草易位系M8657-4抗条锈病基因的遗传分析

[目的]对普通小麦-柔软滨麦草易位系M8657-4的抗条锈病基因进行遗传分析,明确其抗条锈病基因及遗传特点。[方法]用中国小麦条锈菌CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、Su11-4及Su11-11共6个生理小种对易位系M8657-4的苗期抗条锈性进行评价;采用常规杂交法对M8657-4的抗条锈病基因进行遗传分析。[结果]易位系M8657-4对中国小麦条锈菌具有良好的抗性;M8657-4对菌系CYR29和Su11-4的抗锈性由2对核基因(互补作用)控制,对CYR31的抗锈性由1对隐性核基因控制,对Su11-11的抗病性,M8657-4做母本时由2对基因(互补作用)控制,M8657-4做父本时由1对隐性基因控制。[结论]易位系M8657-4的抗条锈性由主效基因控制,可将其作为优良种质加以开发利用。

普通小麦-簇毛麦易位系V8360抗条锈病基因的遗传分析

普通小麦-簇毛麦易位系V8360具有抗逆性强、抗条锈性强和抗白粉性强等许多优良的生物学特性。用9个中国目前流行的条锈菌生理小种对V8360进行了抗条锈性评价,表明该易位系具有良好的抗条锈性。以条锈菌小种CYR32对V8360与感病品种铭贤169配置的F1、F2、F3和BC1代进行苗期抗条锈性遗传分析,并对其中一个F2代群体进行了SSR标记。结果表明,V8360对条锈菌CYR32的抗病性由1对显性核基因控制,暂命名为Yr V8360。从329对SSR引物中筛选到位于小麦4AL染色体上的4个SSR位点Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257与该基因连锁。

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系叶片cDNA文库构建及鉴定

用表达型质粒载体pSPORT 1构建了经白粉菌 (Erysiphegraminis)诱导 48h和未经诱导的小麦 簇毛麦 6VS/ 6AL易位系(Triticumaestivum Haynaldiavillosatranslocationline)叶片cDNA文库各一个。文库宿主菌为E .coliDH10B。非诱导文库包含约 5 0万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段为 1 2 5kb ,主要分布在 40 0bp～ 2 2kb。诱导文库包含约 30万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段 1 2kb。用克隆的病程相关基因 (pathogenesisrelatedgene) 小麦类甜蛋白基因pWIR作探针 ,进行杂交筛库 ,杂交信号明显 。

普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系cyclophilin基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR的方法从普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系克隆到1个cyp基因，命名为Ta-Hv-cyp。该基因全长为599bp，编码1条171个氨基酸残基的多肽，具有保守的功能位点W128和胞质型CyP蛋白特有的插入序列KSGKPLH48-54。BLAST分析表明，推导的Ta-Hv-CyP蛋白分别与小麦、水稻、玉米、拟南芥的胞质型CyP具有98％，88％，85％和80％的氨基酸序列一致性。构建的进化树显示，推导的Ta-Hv-CyP蛋白与单子叶植物胞质型CyPs的亲缘关系较近。

普通小麦-柔软滨麦草易位系的抗条锈性遗传研究

[目的]对普通小麦-柔软滨麦草易位系的抗条锈性进行遗传分析。[方法]以普通小麦-柔软滨麦草易位系M853-2、M853-4、M8657-1、M8657-4及M853-1为材料,用中国小麦条锈菌条中29号、条中30号、条中31号、条中32号、水源11-4和水源11-11共6个生理小种对其抗条锈性进行评价,进而对2个易位系M853-2和M8657-1的抗条锈性进行遗传学分析。[结果]5个易位系的抗病谱存在明显差异,初步推测5个易位系所包含的抗条锈基因不尽相同;M853-2对条锈菌系CY31的抗条锈性由2对基因控制,对Su11-11的抗条锈性由1对显性基因控制;M8657-1对条锈菌CY31的抗条锈性由2对基因控制,对Su11-11的抗条锈性由1对隐性基因控制。[结论]小麦-柔软滨麦草易位系的抗条锈性由主效基因所控制,可将其作为重要抗源在抗锈育种中有目的地加以利用。

4个小麦—柔软滨麦草易位系苗期抗条锈基因的遗传分析

旨在开发和利用柔软滨麦草的基因,丰富小麦抗条锈基因库。利用小麦条锈菌流行小种CYR32和CYR33对M851-1、M8724-1、M8725-2和M8657-2 4个小麦-柔软滨麦草易位系进行苗期抗条锈性遗传分析。结果表明,M851-1对CYR32的抗条锈性由1对隐性基因控制;M8724-1对CYR32的抗条锈性由2对隐性基因独立作用控制,对CYR33的抗条锈性由1对隐性基因控制;M8725-2对CYR32的抗条锈性由2对显性基因互补作用控制,对CYR33的抗条锈性由1显1隐2对基因独立控制;M8657-2对CYR32的抗条锈性由1对隐性基因控制,对CYR33的抗条锈性由2对显性基因独立作用控制。研究结果初步明确这4个小麦-柔软滨麦草易位系抗条锈性遗传规律,有助于进一步利用这些易位系进行小麦抗条锈病育种。

小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439中蛋白激酶基因的克隆

[目的]克隆和分析小麦受体蛋白激酶基因片段。[方法]对经白粉菌诱导24 h的小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439叶片中cDNA进行5′-RACE,获得小麦受体蛋白激酶基因的部分片段,并分析其蛋白质序列同源性。[结果]通过RACE获得了长度为1 708bp的小麦受体蛋白激酶基因片段。该片段的氨基酸序列(S1125)与基因Lrk19在641个氨基酸跨度内有86%相同,91%相似。S1125与小麦抗锈病基因Lrk10在636个氨基酸跨度内有84%相同,88%相似。S1125可能为丝氨酸-苏氨酸激酶。[结论]所克隆的小麦蛋白激酶基因片段与Lrk19基因和小麦抗锈病基因Lrk10具有较高的同源性。

小麦—异源易位系及其在育种中的应用

本文综述了诱导小麦—异源异位系的方法、精确鉴定外源染色体及其片段的各种技术 ,指出小麦—异源异位系是小麦遗传研究的重要基础材料 。

抗白粉病的小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439的cDNA文库构建

用pGEMT-easy质粒载体构建了经白粉菌诱导0.5 h、1.0 h、12 h、24 h和48 h的小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439叶片cDNA文库1个.文库宿主菌为E.coliDH10B,诱导文库平均插入片段为1 kb左右.

从小麦-簇毛麦易位系TAC文库中筛选Hv-S/TPK基因

本实验室已经通过基因芯片技术筛选到一个白粉菌诱导后上调表达的抗病相关基因Hv-S/TPK,并获得了它的全长cDNA序列。利用Hv-S/TPK的特异引物筛选小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系基因组可转化人工染色体(Transformation-competent artificial chromsome,TAC)文库,获得了阳性TAC单克隆,并进一步获得了含有Hv-S/TPKcDNA序列的5160bp(GenBank Accession No.EU153366)的亚克隆。对亚克隆的序列分析结果表明,Hv-S/TPK基因在起始密码子和终止密码子之间有3个内含子和4个外显子,4个外显子序列与簇毛麦上已得到的Hv-S/TPK的cDNA序列100%同源。对起始密码子上游序列分析结果表明,该基因的调控序列中,含有W-Box、OCS-element等与抗病相关的元件。以TAC克隆为探针与小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH),结果表明含有Hv-S/TPK基因的TAC克隆来自于簇毛麦。

寡核苷酸探针套涂染结合基因组原位杂交和分子标记分析准确鉴定小麦-百萨偃麦草异源易位系的研究

培育小麦异源易位系是转移和利用外源基因的有效途径,快速准确的染色体鉴定方法有利于提高染色体工程效率。本研究以电离辐射诱致的2个普通小麦-百萨偃麦草染色体5J易位系(NAU16YJ127和NAU16YJ124)为例,分析了综合利用本课题组前期开发的寡核苷酸探针套[包括(GAA)10、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4六个寡核苷酸探针]涂染,结合基因组原位杂交和分子标记等方法鉴定小麦异源易位系的效果。结果表明,NAU16YJ127(2n=6x=42)包含一对小麦-百萨偃麦草易位染色体T5JS·5JL-5AL#1,同时在染色体6A和2D长臂顶端也发生了明显的相互易位;NAU16YJ124(2n=6x=44)附加了一对小麦-百萨偃麦草易位染色体,同时包含一对6A长臂缺失染色体del6AL,其缺失区段易位到5JL近端部,形成T5JS·5JL-6AL,其他染色体未见明显变化。利用21个5J特异分子标记(19个位于长臂和2个位于短臂)分析发现,两个易位系均含有全部5J短臂标记,同时T5JS·5JL-5AL#1含有12个长臂标记,而T5JS·5JL-6AL仅含有2个长臂标记,确证两个易位系断点不同,并将21个标记定位于4个不同区段,其中位于5J短臂的2个标记位于1个区段,位于5J长臂的19个标记位于3个区段(5JL-1~3),分别包含2、10和7个标记;发现3个为可以同时识别5J和5A的共显性标记,其中NAU16YJ124含有全部5A标记,而NAU16YJ127仅包含其中2个标记,进一步验证了细胞学鉴定结果。本研究结果表明,寡核苷酸探针套涂染、基因组原位杂交和分子标记分析相结合为准确鉴定小麦异源易位系提供了新方法。

利用染色体C-分带和双色荧光原位杂交技术鉴定普通小麦-黑麦-簇毛麦双重易位系1RS·1BL,6VS·6AL

为改进小麦－黑麦 １ＲＳ· １ＢＬ易位系的抗病性，丰富栽培小麦品种的遗传多样性，本文通过１ＲＳ·１ＢＬ与６ＶＳ·６ＡＬ易位系杂交，在后代中利用染色体ＣＷ带技术从杂种Ｆ２中鉴定出小麦－黑麦－簇毛麦双重易位纯合体 １ＲＳ· １ＢＬ，６ＶＳ· ６ＡＬ（２ｎ＝ ４２），ＰＭＣ ＭＩ染色体平均构型为１９．１４ ＋１．８６ ，表明该易位系具有良好的细胞学稳定性；利用生物素和地高辛分别标记的黑麦和簇毛麦基因组ＤＮＡ为探针进行双色荧光原位杂交，在ＲＴＣ和ＰＭＣ中均清晰地观察到呈黄绿色的黑麦染色质和呈红色的簇毛麦染色质，小麦染色质呈蓝色，进一步证实了Ｃ－分带结果。该易位系育性正常，并具有良好的农艺性状和白粉病抗性，是同时利用１ＲＳ·１ＢＬ和６ＶＳ·６ＡＬ易位染色体进行小麦品种改良和遗传研究的有用种质。

普通小麦–大赖草易位系T5AS-7LrL·7LrS分子细胞遗传学鉴定

大赖草对赤霉病具有较好的抗性,将大赖草赤霉病抗性基因转入普通小麦,对拓宽小麦赤霉病抗性基础有重要意义。本研究在获得抗赤霉病普通小麦–大赖草异附加系基础上,采用^(60)Co-γ射线(1200Rad,剂量率100Rad min^(-1))处理小麦–大赖草二体附加系DA7Lr,并用处理后的花粉授给去雄的普通小麦中国春,对其M_1代种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析,获得1株具有一条普通小麦–大赖草易位染色体的植株,对其自交后代中具有2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂中期I观察发现,2条易位染色体形成了稳定的环状二价体,表明该植株为纯合体。利用顺序GISH–双色FISH分析,结合C-分带、小麦D组专化探针Oligo-pAs1-2和B组专化探针Oligo-pSc119.2-2,进一步鉴定出该易位系为T5AS-7LrL·7LrS,同时筛选出可追踪该易位系的3个EST-STS分子标记,即BE591127、BQ168298和BE591737。该易位系的育成也为小麦赤霉病遗改良提供了新种质。

1BL·1RS特异性分子标记的筛选及其对不同来源小麦品种1RS易位染色体的鉴定

1BL·1RS易位系在我国小麦育种和生产中占有重要地位,快速而准确地鉴定1BL·1RS易位系对小麦品质改良具有重要意义。本研究选用15个1BL·1RS特异性STS、SCAR和RAPD标记及22个1RS染色体上的SSR标记,检测不同来源的1BL·1RS易位系78份以及非1BL·1RS易位系品种10份和黑麦材料3份,其中1BL·1RS易位系包括周8425B及其衍生系36份、兰考906及其衍生系5份、矮孟牛及其衍生系8份和洛类1BL·1RS易位系品种29份。结果表明,7个STS标记、1个SCAR标记、3个RAPD标记和3个黑麦SSR标记可作为鉴别1BL·1RS易位系的可靠分子标记,其中ω-sec-p1/ω-sec-p2、ω-sec-p3/ω-sec-p4、H20和SECA2/SECA3标记最好,扩增效果稳定,重复性好,条带清晰,实验操作简单。周8425B及其衍生系、兰考906及其衍生系、矮孟牛及其衍生系与洛类1BL·1RS易位系的1RS染色体在分子标记检测中没有差异。

簇毛麦6VS特异转录序列P21461及P33259的获得及其分子标记在鉴定小麦-簇毛麦抗白粉病育种材料中的应用

簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂分别携带抗白粉病基因Pm21和Pm V,在与小麦的杂种后代中,抗病基因与外源染色体臂共分离。开发鉴定2条外源染色体臂间多态性的序列,尤其是遗传信息相对缺乏的6V#4S染色体臂的序列,对于其在遗传与育种上的应用具有重要意义。本研究以携带6V#4S·6DL染色体的小麦易位系Pm97033及感病小麦亲本宛7107接种白粉菌的叶片转录组数据为资源,通过差异基因筛选、共线性分析、簇毛麦基因组扩增及测序验证的方法,鉴定出来自6V#4S的表达序列P21461和P33259,其中基于P21461序列设计的引物P461-5在簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂的扩增产物具有30 bp的In Del和4 nt的多态性。用该引物转化的标记P461-5a可以鉴定抗白粉病小麦品种和高代品系所含的外源染色体,显示其在簇毛麦抗源鉴别和小麦抗病育种辅助选择中潜在的应用价值。根据P33259开发的标记P259-1可以对含有6V#4S染色体臂的材料进行特异扩增,但对6V#2S·6AL易位染色体没有扩增产物,因此P259-1可作为6V#4S·6DL易位染色体的特异分子标记。q RT-PCR分析结果显示,P21461的表达不受白粉菌诱导,而P33259在接菌后12 h和24 h的转录水平比接菌前提高约2倍,推测其可能参与Pm97033与白粉菌的早期互作。