转PsnNAC007高耐旱性小黑杨种质创制及其特性分析

小黑杨(Populus simonii×P.nigra)是东北地区速生、耐寒、材性优良的树种。为了创制适种范围广、耐旱性状明显改良的林木新种质,利用小黑杨为材料,以干旱胁迫关键响应因子PsnNAC007转录因子为对象,创制了小黑杨过表达OE-PsnNAC007转基因植株。对OE-PsnNAC007转基因植株的生长指标、干旱胁迫适应能力、净光合速率(P_(n))、蒸腾速率(T_(r))、气孔导度(G_(s))、导水率指标、细胞形态和木材组分进行分析。结果显示:与野生型小黑杨相比,转基因植株的生长情况无明显差异,而干旱胁迫成活率提高了26.15%。在干旱胁迫条件下,转基因植株气孔导度减小、蒸腾速率下降、水分利用效率明显提高,植株茎干的导水率损失显著减少。解剖学分析发现,PsnNAC007的过量表达导致植株茎干产生更多、更小的导管细胞,这种细胞特性有利于植株在干旱条件下维持水分连续高效的运输。木材组分分析发现,转基因植株茎干木质素沉积明显增强,构成纤维素、半纤维素的单糖含量均无明显变化。

抚育间伐对小黑杨人工林非结构性碳和氮磷钾生态化学计量特征的影响

了解不同林龄阶段小黑杨人工林各器官的非结构性碳(NSC)含量和氮(N)磷(P)钾(K)生态化学计量特征及其对抚育间伐的响应,从而为小黑杨人工林的科学经营提供依据。以黑龙江省大庆市红旗林场幼龄和中龄小黑杨人工林为研究对象,建立间伐强度为25%(以株数计)的抚育间伐样地,调查分析抚育间伐对小黑杨人工林各器官NSC含量和NPK生态化学计量的影响特征。研究结果表明,2种林龄小黑杨人工林具有各自不同的NSC含量和NPK生态化学计量分布特征。中龄林树叶、树枝和树根NSC含量较幼龄林分别降低31.76%、21.19%、38.98%(P<0.05)。中龄林树叶N含量较幼龄林增加11.85%(P<0.05)。中龄林树枝、树干和树根P含量分别较幼龄林分别降低17.57%、35.85%、60.11%(P<0.05),树叶、树枝、树干和树根K含量分别较幼龄林分别降低21.05%、34.67%、22.99%、46.22%(P<0.05)。抚育间伐显著影响小黑杨幼龄林树干和树根的NSC含量、中龄林树枝和树根的NSC含量(P<0.05)。抚育后幼龄林树干NSC含量增加29.35%,树根NSC含量降低40.37%;中龄林树枝和树根NSC含量分别增加12.81%、33.51%。抚育间伐显著影响小黑杨幼龄林各器官N含量、树枝K含量、树干P含量和中龄林树叶、树根K含量(P<0.05)。抚育后小黑杨幼龄林树叶、树枝、树干和树根N含量分别增加5.77%、15.68%、53.71%、10.85%,树枝K含量增加36.90%,树干P含量降低19.63%;小黑杨中龄林树叶和树根K含量分别增加20.86%、31.69%。树叶NSC含量与N含量极显著负相关(P<0.01),与K含量间显著正相关(P<0.05);树枝NSC含量与N含量显著负相关,与P含量显著正相关(P<0.05),与K含量极显著正相关(P<0.01);树干NSC含量与N含量极显著正相关(P<0.01);树根NSC含量与N含量极显著负相关,与P含量极显著正相关(P<0.01)。结果表明,林分未进行抚育时,小黑杨幼龄林和中龄林NSC和N、P、K元素在各器官中的分配格局差异明显;幼龄林碳资源更多地分配给根系,促使其生长延伸,中龄林更多地投入到树木地上部分生长与竞争。抚育间伐会改变小黑杨NSC和N、P、K在各器官中的分布格局,抚育后,2种林龄小黑杨地上部分与地下部分碳资源比例均发生改变。对小黑杨中龄林进行抚育间伐增加林木碳汇的同时也改善了P限制的状况。

欧黑青杨和小黑杨在山地栽培的对比研究

对栽植在四平市铁东区山地不同坡位的21年生小黑杨和欧黑青杨进行材积生长对比试验。结果表明:品种杨对水分的需要更重于对土壤养分的需要,其人工林抚育浇水重于施肥;品种杨通常适宜在平地和山坡下腹地栽培,而对于速生的欧黑青杨适于在平地和山坡中腹、下腹部位栽培。

白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用

以白城小黑杨(Populus simonii×P.nigra‘Baicheng’)组培苗茎段为外植体,MS为基本培养基,通过调节不同植物生长激素6-BA、NAA、TDZ和IBA浓度诱导其离体再生。基于组织培养系统,经过卡那霉素浓度筛选、侵染时间确定,最终建立适用于白城小黑杨的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化体系。利用该系统成功创制了杨树应拉木形成关键调控基因LBD39(Lateral Organ Boundaries Domain)的过量表达转基因植株。结果表明:白城小黑杨组织培养体系包括不定芽分化诱导、抽茎诱导、生根诱导3个阶段,不定芽分化诱导最适培养基为MS+0.5 mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA+0.001 mg·L^(-1)TDZ,分化率92.6%;抽茎诱导最适培养基为MS+0.2 mg·L^(-1)6-BA+0.05 mg·L^(-1)NAA,抽茎增值系数6.5;生根诱导最适培养基为1/2 MS+0.4 mg·L^(-1)IBA,生根率100%。遗传转化最适卡那霉素质量浓度为30 mg·L^(-1)、最佳侵染时间为20 min,经30 d不定芽诱导、15~30 d抽茎诱导、25 d生根诱导即可成功获得转基因植株,GUS基因的转化效率为2%。应用此遗传转化体系,对杨树应拉木关键调控基因LBD39进行了过表达植株创制,最终获得5株过表达植株,转化效率为3.3%。

小黑杨RAV1与RAV2基因的克隆与表达分析

【目的】克隆小黑杨(Populus×xiaohei T.S.Hwang et Liang)RAV1和RAV2基因,分析这2个基因在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究小黑杨基因功能提供理论依据。【方法】以抗逆性强的小黑杨根为试材,克隆2个RAV家族成员。利用生物信息学方法对小黑杨2个RAV基因的理化性质、保守基序、保守结构域、系统进化进行分析,并采用半定量RT-PCR方法探讨这2个基因在小黑杨顶芽、叶、木质部、韧皮部、根、第1~14片叶、第1~11茎节中的表达情况,以及在CdCl2、NaCl、NaHCO3、PEG和ABA胁迫下的表达特性。【结果】从小黑杨中克隆出2个RAV基因,命名为PsnRAV1和PsnRAV2。PsnRAV1编码405个氨基酸,预测分子质量约为99.46 ku,等电点5.06,不存在信号肽;PsnRAV2编码407个氨基酸,预测分子质量约为99.33 ku,等电点5.06,存在信号肽;2个基因均位于细胞核上。保守结构域和保守基序分析结果表明,小黑杨RAV蛋白具有RAV家族特有的AP2和B3这2个保守蛋白结构域,基序1、2、3是构成2个结构域的主要基序。系统进化分析表明,20种植物的RAV蛋白分为3组,其中PsnRAV1和PsnRAV2与毛果杨(Populus trichocarpa)RAV同源性很高。半定量RT-PCR分析结果显示,2个PsnRAVs基因在小黑杨的顶芽、叶、木质部、韧皮部和根中均有表达;且随着叶和茎的发育,2个基因的表达量均呈现升高的趋势。在CdCl2、NaCl、NaHCO3模拟的重金属及盐胁迫下,2个基因的表达模式虽不相同,但在根部均受到诱导;在PEG模拟的干旱胁迫下,PsnRAV1和PsnRAV2在叶片和根部均有响应,其中在根部受到的诱导更为明显,尤以PsnRAV2的表达更为显著;此外,PsnRAV1和PsnRAV2也受到ABA的诱导,其在叶中的表达量在初期表现为上升,而后期下降。【结论】2个PsnRAVs基因与小黑杨的抗逆性密切相关,可能参与了小黑杨的非生物胁迫应答,其中PsnRAV2在胁迫下的作用更为显著。

大青杨×小黑杨异源三倍体新种质创制

为向杨树良种选育提供新种质,以秋水仙素为诱变剂,采用大孢子染色体加倍、胚囊染色体加倍,这2种2n雌配子诱导途径创制大青杨小黑杨异源三倍体,调查各试验组的结种、育苗表现,筛选、鉴定出三倍体后,调查苗期的苗高地径、叶片性状、气孔性状、总叶绿素质量分数。研究结果表明:①相同培养条件时,大青杨雄花序露出芽鳞1/2、花药呈红色至深红色、小孢子发育至单核靠边期,且雌花的花序未露出芽鳞时,是诱导大青杨大孢子染色体加倍的合适时机,采用质量分数为0.5%的秋水仙素溶液在24 h内对雌花芽进行3次注射处理为最佳诱导方案。②授粉后54~60 h是诱导大青杨胚囊染色体加倍的有效时期,授粉后54 h时,采用质量分数为0.5%的秋水仙素溶液袋浸处理雌花序18 h为最佳诱导方案。③共获得了7株大青杨小黑杨异源三倍体,其中大孢子染色体加倍途径获得5株,胚囊染色体加倍途径获得2株。④落果率低、种子质量低、成苗率高、配子育性佳的试验组更有可能存在三倍体,结种、育苗表现可作为三倍体前期筛选的参考指标。⑤苗期性状观测后发现大青杨小黑杨异源三倍体具有巨大性和一定的生长优势,这些异源三倍体为今后杨树良种选育与遗传研究提供了可利用的新材料。

小黑杨转录因子PsnbHLH162基因在盐和低温胁迫下应答分析

为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbHLH162在植物体内发挥的作用,同时探究该基因在植物体内的信号转导过程,进而为未来获取优良的抗逆树种提供理论基础。以小黑杨为原材料,克隆获取PsnbHLH162基因,对目的基因和启动子进行生物信息学分析;之后用150 mmol·L^(-1)NaCl、4℃低温分别对野生型小黑杨进行胁迫处理,利用荧光定量PCR,分析基因响应非生物胁迫的功能。结果显示:PsnbHLH162 cDNA基因片段长537 bp,基因N端内含1个高度保守的HLH结构域。该基因表达蛋白是不含跨膜区域的稳定的亲水性蛋白,其定位在细胞核内且没有转录激活活性。启动子区域内含多种ABA应答、生长素应答、光应答和circadian元件,证实此基因参加非生物胁迫应答。荧光定量PCR结果表明在盐胁迫下,与茎、叶组织相比,基因在根组织的表达量最高;在低温胁迫下,与叶、根组织相比,基因在茎组织的表达量最高。发现野生植株内,PsnbHLH162能被盐、低温诱导表达。

PsnHB13与PsnHB15在小黑杨中的遗传转化与功能分析

PsnHB13与PsnHB15为小黑杨(Populus simonii×P.nigra)周期蛋白PsnCycD1;1过表达株系转录组差异基因。为探究PsnHB13与PsnHB15基因功能,使用InterPro工具对PsnHB13与PsnHB15保守结构域进行分析,通过STRING数据库对PsnHB13和PsnHB15蛋白质关联网络分析,酵母双杂交验证互作蛋白,统计转基因植株叶片长宽比、叶片和茎部干质量与鲜质量比值,并对PsnHB13过表达小黑杨进行转录组分析。结果显示PsnHB13与PsnHB15分属于2个不同亚家族,PsnHB13主要包含HDZipⅠ结构域,PsnHB15主要包含HDZipⅢ结构域。PsnHB13和PsnHB15蛋白质关联网络分析,均筛选到10条互作蛋白,且PsnHB15对家族蛋白具有较高的互作概率。酵母双杂交结果显示PsnHB15与PsnHB13互作,PsnHB13与PsnCycD1;1互作。PsnHB13与PsnHB15过表达小黑杨株系在幼苗初期叶片长宽比均明显增加。PsnHB13过表达株系茎部干质量与鲜质量比值显著增加(P<0.05)。PsnHB13过表达小黑杨转录组分析显示,差异基因GO富集主要集中在对化学物质的反应、对有机物的反应、调节RNA代谢过程等方面。KEGG富集在转录因子、植物激素信号转导、细胞色素P450等通路。差异基因主要集中在MADS-box、MYBP、ERF1、GH3、SAUR等家族。PsnHB13与PsnHB15在小黑杨的生长发育中发挥着重要的功能,是探究植物的生长规律、揭示细胞周期与生长调节之间的关键基因。

小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^(-1)NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana)瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因相互作用。

小黑杨PsnWRKY14基因应答盐胁迫表达模式

为了探究小黑杨(Populus simonii×P.nigra)PsnWRKY14基因应答盐胁迫的表达模式,从小黑杨中克隆得到全长为687 bp的PsnWRKY14基因cDNA编码序列。生物信息学分析表明:该蛋白不含信号肽和跨膜结构域,属于较不稳定的亲水性蛋白质;亚细胞定位分析发现PsnWRKY14蛋白为核定位蛋白。PsnWRKY14基因具有组织特异性,在茎中的表达量最高,盐胁迫条件下在根、茎、叶等组织中的表达量均呈现先上升后下降的趋势,在24 h达到峰值。将pGBKT7-PsnWRKY14重组质粒导入Y2HGold酵母感受态细胞,验证了PsnWRKY14转录因子不具备自激活活性。该基因启动子含有可以响应茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸、赤霉素等激素应答元件,此外还含有响应低温以及对厌氧诱导等与抗逆相关的顺式作用元件,推断该基因可能参与小黑杨的抗逆防御调控过程。

耐盐基因Bet-A转化小黑杨的研究

本研究建立了小黑杨 (Populussimonii×P .nigra)组培再生体系 ,确定小黑杨芽分化最适宜培养基、生根培养基 ,然后进行卡那霉素敏感性试验。以小黑杨无菌苗叶片为转化受体材料 ,通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)介导法将外源基因Bet A(编码胆碱脱氢酶 ,催化胆碱生成甘氨酸甜菜碱 )导入小黑杨(P .simonii×P .nigra)。对获得的 11株转化苗进行了PCR扩增检测和斑点杂交检测 ,其中 7株获得了 1 7Kb特异性扩增条带和杂交斑点 ,表现为阳性。从斑点杂交检测的转化苗中选取 3株杂交斑点明亮的转化子进行Southern印迹杂交分析 。

华北沙地小黑杨人工林生物量及其分配规律

应用相对生长法对不同密度华北沙地小黑杨人工林生物量及其分配规律进行研究。结果表明,用模型W=aDb估测的27年生1000、500和250株.hm-2的小黑杨林分生物量分别为85.23、102.60和86.74t·hm-2;29年生小黑杨林分生物量分别为88.64、104.90和90.94t·hm-2。林分生物量与林分的密度和年龄密切相关,呈现出随着密度增加而先增加后减少、随着林龄增加而增加的规律。密度对小黑杨器官间生物量分配有重要影响。密度不同,器官生物量所占比例不同,其中,叶和皮生物量所占比例均随着密度增加而增加,干、枝和根生物量所占比例随密度增加没有表现出明显规律性。在3种密度中,干生物量所占比例最大,叶生物量所占比例最小。3种密度小黑杨林分生物量的径阶分配呈正态分布,在1000株·hm-2的小黑杨林分中72.37%的生物量集中在18～22cm的径阶范围内;500株·hm-2小黑杨林分中生物量主要集中在20～26cm的径阶范围内,占总生物量的90.02%;250株·hm-2的小黑杨林分中,生物量主要集中在26～30cm的径阶范围内,占总生物量的68.27%。

农杆菌抑菌剂的抑菌效果及其对小黑杨叶片不定芽产生率的影响

研究了几种抗生素及AgNO3对农杆菌的抑菌效果和对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的影响。确定首选抑菌抗 生素是头孢噻肟钠,AgNO3的抑菌效果也很好,两者的有效抑菌浓度分别为200和3.0 mg·L-1,抑菌时间均为9 d,此浓 度下小黑杨叶片的不定芽产生率为88％和89％。

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populus simonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性。抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用。

转betA基因小黑杨的耐盐性分析及优良转基因株系的选择

在前期获得13个小黑杨转胆碱脱氢酶基因(betA)株系的基础上,选择9个生长正常的转基因株系与非转基因对照,用0、100、140、170、200mmol·L-15种浓度的NaCl处理盆栽苗木,分2、7、12、17、22d取处理材料叶片,测定转基因株系叶片中外源基因的最终合成产物———甜菜碱含量。盐处理60d后,测定苗木高度及转基因株系的盐害指数。结果表明,转基因株系与对照间的甜菜碱含量差异达到极显著水平,9个转基因株系的甜菜碱平均含量超过对照的27.1%;转基因株系的平均盐害指数较对照低15.8%;转基因株系的平均高度超过对照44.1%。综合转基因株系的生长速度,兼顾其耐盐性,初步选择转基因株系T4、T6、T5、T1作为生长速度快耐盐性高的优良株系。

华北沙地小黑杨人工林生长特性

对华北沙地小黑杨人工林生长特性进行研究。结果表明：小黑杨树高生长要早于胸径生长,生长中后期单株之间对资源的竞争增强;树高连年生长量最大值与平均生长量最大值几乎同步出现,胸径亦如此,而材积的连年生长量最大值比平均生长量最大值要早3年左右出现;树高连年生长量在接近第6年时与平均生长量相交,胸径连年生长量和平均生长量在第10年左右时相交,材积连年生长量和平均生长量在接近第16年时相交;黑杨生长过程分为4个时期：第0-3年为幼林期,第4-14年为速生期,第15-16年为近熟期,第17-26年为成熟期;轮伐期在16年左右。

转TaLEA基因小黑杨株系变异及生长稳定性分析

以6个地点栽培的11个转TaLEA基因小黑杨株系及1个对照株系为材料,对2年生株系的树高和地径进行调查分析。方差分析结果表明:树高、地径在不同地点间、不同株系间的差异达极显著水平(P<0.01),株系×地点间的交互作用达显著水平(P<0.05);不同地点12个小黑杨转基因株系2年生树高平均值变化范围为128～235cm,地径变化范围为13～24mm;不同地点参试株系树高和地径变异系数变化范围分别为19.84%～33.38%和24.21%～49.16%;重复力变化范围为0.497～0.952,表明相同地点不同株系树高和地径差异较大,但差异主要由遗传因素控制,有利于株系选择。采用Tai模型对各株系的遗传稳定性进行评价,其中XL11株系为不稳定株系,其他11个为稳定性较强的株系。根据各株系的稳定性参数和树高与环境的交互作用效应值,预测了各株系的适生地区,其中XL9、XL1、XL14等3个株系在6个试验地点的生长量大、稳定性强,是6个试验点推广的首选株系。

向小黑杨转化蜘蛛杀虫毒素基因(英文)

近年来,危害小黑杨Populussimonii×P.nigra的害虫发生严重,给林业生产造成很大损失。为了提高小黑杨的抗虫能力,避免使用杀虫剂带来的污染,用农杆菌介导法将澳大利亚漏斗蛛Atraxrobustus的毒蛋白基因和苏云金芽孢杆菌CryⅠA(b)基因C末端的融合基因BGT转化入小黑杨。PCR和Southern印记分析转基因植株,结果表明,BGT杀虫基因已经整合在小黑杨基因组上。活性实验表明,取食转基因杨树6天和9天后,舞毒蛾Lymantriadispar2龄幼虫的校正死亡率分别是37.0%和92.6%。方差分析表明取食转基因和对照杨树的舞毒蛾幼虫体重差异显著。这些结果显示转基因杨树上的舞毒蛾的发育速率受到影响。

以胆碱脱氢酶基因对小黑杨花粉植株的遗传转化

以小黑杨(Populussimonii×P.nigra)花粉植株叶片为外植体,用根癌农杆菌介导法将胆碱脱氢酶基因(betA)导入其中,将获得的4株卡那霉素抗性转基因株系进行PCR检测,结果均为阳性。用荧光定量PCR对转基因株系的betA基因转录结果检测表明,4个转基因株系均已表达外源基因,但表达量有差异。对获得的4株转基因株系及对照进行NaCl胁迫处理,当NaCl浓度为0.55%时,非转基因小黑杨花粉植株生根率为0,转基因株系生根率为80%￣100%;在NaCl为0.70%￣0.80%时,则转基因株系生根率也为0。4个转基因株系的甜菜碱含量显著高于未转基因对照,说明betA基因的导入提高了转基因株系的耐盐性。

小黑杨胸径和树高的生长动态

以张家口市坝上地区张北县、沽源县无性繁殖苗造林的小黑杨为研究对象,采用树干解析法获取3种方式繁殖(插条、断根和埋桩)造林的小黑杨的树高和胸径生长数据,利用Richards生长曲线方程和加权平均法,比较分析小黑杨胸径和树高生长,结果表明:1)3种不同方式繁殖的苗木胸径生长曲线均呈"S"状,有较高的相关性;2)利用Richards生长曲线推测出的胸径值表现为断根小黑杨>埋桩小黑杨>插条小黑杨;树高推测值表现为埋桩小黑杨≈插条小黑杨>断根小黑杨。