麦门冬汤对间质性肺炎小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞自噬及肺水清除的作用机制研究

[目的]观察麦门冬汤对间质性肺炎小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞自噬及对肺水清除的影响,并探究其作用机制。[方法]将120只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级C57BL/6小鼠随机分为6组:正常组、模型组、强的松组及麦门冬汤高、中、低剂量组,每组20只。除正常组小鼠经鼻腔滴注0.9%氯化钠溶液之外,其余各组小鼠均通过鼻腔滴注博来霉素(bleomycin,BLM)建立间质性肺炎模型。造模后,麦门冬汤高、中、低剂量组小鼠分别灌胃给予17.16g·kg-1、8.58g·kg-1、4.29g·kg-1麦门冬汤,强的松组小鼠灌胃给予0.46g·kg-1强的松,正常组和模型组小鼠灌胃给予等量蒸馏水,均为1次/d,连续28d。实验结束分离小鼠肺组织,计算肺组织湿干重比(wet/dry weight ratio,W/D);以Evans Blue法计算肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC);苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠肺组织病理变化;Masson染色观察肺组织纤维化情况,羟脯氨酸测定胶原表达水平;免疫黏附法分离Ⅱ型肺泡上皮细胞,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、p62、自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、磷酸化磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphorylated-phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphophorylated-protein kinase B,p-AKT)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)表达水平。[结果]与正常组比较,模型组小鼠肺组织W/D值显著升高,AFC降低(P<0.05)。HE染色和Masson染色显示模型组小鼠肺组织正常结构基本消失,纤维化显著,肺组织羟脯氨酸含量显著升高,胶原蛋白显著增加,肺泡Ⅱ型肺泡上皮细胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达均显著增高,LC3-Ⅱ表达降低(P<0.05)。与模型组比较,麦门冬汤各剂量组和强的松组小鼠肺组织W/D值均降低,AFC均升高,其中麦门冬汤高、中剂量组W/D值低于强的松组,AFC高于强的松组(P<0.05)。麦门冬汤高、中剂量组小鼠肺组织肺泡结构相对清晰,肺纤维化得到改善,胶原蛋白减少,但麦门冬汤低剂量组和强的松组小鼠肺组织仍存在明显纤维化情况,胶原蛋白沉积明显。与模型组比较,麦门冬汤各剂量组和强的松组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达均降低,LC3-Ⅱ蛋白表达均增加(P<0.05),其中麦门冬汤高、中剂量组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达低于强的松组,LC3-Ⅱ蛋白表达高于强的松组(P<0.05),而麦门冬汤低剂量组上述蛋白表达与强的松组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]麦门冬汤对小鼠间质性肺炎和肺水清除有改善作用,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,增强肺组织细胞自噬活性有关。

miR-483-3p靶向APPL1对脂多糖诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨miR-483-3p对脂多糖(LPS)诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响及可能机制。方法LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-483-3p和磷酸酪氨酸衔接蛋白1(APPL1)mRNA表达水平,酶联免疫吸附法检测细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹(Western Blot)法检测细胞中APPL1、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)蛋白表达水平。转染miR-483-3p抑制剂或APPL1过表达载体构建miR-483-3p表达干扰或APPL1过表达小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞。LPS诱导干扰miR-483-3p表达或过表达APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后,上述相同方法检测细胞中MDA和SOD水平、细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-483-3p与APPL1调控关系。结果LPS诱导细胞后,细胞中miR-483-3p和MDA表达、细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高(P<0.05),APPL1的mRNA和蛋白、SOD活性及Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。干扰miR-483-3p表达或过表达APPL1后,LPS诱导的细胞中MDA含量、凋亡率和Bax蛋白表达降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05)。miR-483-3p在小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中靶向负调控APPL1表达。抑制APPL1表达逆转了干扰miR-483-3p对LPS诱导的细胞中MDA和SOD水平、细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。结论干扰miR-483-3p表达可能通过负调控抑制APPL1表达抑制LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡,减轻细胞损伤。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。

类视黄醇X受体对缺氧/复氧诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激反应的调控作用

目的:探讨类视黄醇X受体(RXR)在缺氧/复氧(HR)诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)氧化应激反应中的调控作用。方法:随机将细胞实验分成5组:对照(C)组、HR组、HR+溶剂二甲基亚砜(DMSO)组(HD组)、HR+RXR激动剂9-顺式维甲酸(9-RA)组(RA组)和HR+RXR抑制剂HX531组(HX组)。采用CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光法进行AECⅡ特异性指标表面活性物质蛋白A(SP-A)的鉴定和RXRα表达的观察;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;透射电镜观察细胞内超微结构的变化;Western blot检测核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白水平;RT-PCR检测Nrf2的mRNA表达水平。结果:与C组相比,HR、HD、RA和HX组细胞活力均显著降低(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量显著增高(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01);与HR和HX组相比,RA组细胞活力增加(P<0.05),SOD活性上升(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01)。结论:HR可加剧大鼠AECⅡ的氧化应激反应,RXR激动剂干预后可通过抑制氧化应激反应减轻HR引起的大鼠AECⅡ损伤。

构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

背景:肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用,它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系,为了对这些疾病进行体外实验研究,必须对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型。目的:建立一套可靠的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法,为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础。方法:①用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法,分离小鼠肺组织细胞成分。取出小鼠肺组织,剪成小块,加入胰蛋白酶,移出细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM中止消化;同法用胰蛋白酶再消化1次,中止消化后加入Ⅰ型胶原酶,再中止消化。②经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,进行原代培养。将肺细胞悬液接种入包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出未黏附细胞,去上清,重悬沉淀,将细胞接种于培养皿和培养板中培养。倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,测定肺泡Ⅱ型上皮细胞产量、纯度及活力,免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表达,透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性细胞结构。结果与结论:用此方法,每只小鼠获得肺泡Ⅱ型上皮细胞(4.8±1.2)×106,纯度达到(85.0±2.4)%,细胞活力为(92.0±2.4)%,倒置显微镜下原代肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形,细胞质内有大量反差明显的细小颗粒,细胞为岛状生长方式;免疫细胞化学鉴定,肺泡表面活性蛋白A呈棕黄色,肺泡表面活性蛋白C呈绿色,均定位表达于细胞浆;透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛。证实利用胰酶联合胶原酶消化,差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的AECⅡ,能满足一般的体外实验要求。

布地奈德、卡介苗干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的观察布地奈德(BUD)、卡介苗(BCG)干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)损伤的影响。方法昆明小鼠40只随机分为哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组和正常对照组。以卵白蛋白致敏和激发复制小鼠哮喘模型,并行BUD、BCG干预。HE染色观察其呼吸道周围嗜酸性粒细胞(EOS)浸润。ELISA法检测其血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中Krebs vonden lungen-6(KL-6)表达及BALF中IL-4、IFN-γ表达。免疫组织化学染色(SABC法)观察其肺表面活性蛋白(SP-A、SP-B)的表达。透射电镜观察其ATⅡ形态。结果哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组、正常对照组EOS分别为(806±91)个.mm-2、(173±25)个.mm-2、(189±19)个.mm-2及(3±1)个.mm-2;血清KL-6水平分别为(1.514±0.027)ng.L-1、(1.101±0.020)ng.L-1、(1.008±0.019)ng.L-1及(0.753±0.033)ng.L-1;BALF中KL-6水平分别为(0.842±0.020)ng.L-1、(0.268±0.024)ng.L-1、(0.243±0.026)ng.L-1及(0.090±0.015)ng.L-1;BALF IL-4水平分别为(22.61±2.35)ng.L-1、(13.34±2.41)ng.L-1、(15.56±3.08)ng.L-1及(0.62±0.15)ng.L-1;BALF IFN-γ水平分别为(40.56±3.58)ng.L-1、(60.37±6.41)ng.L-1、(57.87±6.28)ng.L-1及(75.64±6.09)ng.L-1;SP-A IOD值分别为45.89±10.08、181.34±29.41、200.12±32.08及389.62±45.05;SP-B IOD值分别为10.34±2.42、88.76±12.66、87.13±14.58及187.89±27.15。上述指标除BUD干预组与BCG干预组之间差异无统计学意义外,余各组间差异均有统计学意义(Pa<0.01)。电镜下可见哮喘模型组小鼠ATⅡ板层小体和线粒体减少,有明显排空和空泡化改变,部分细胞变性、坏死。干预后上述改变均有明显改善。哮喘模型组、BUD干预组及BCG干预组BALF中KL-6水平与EOS呈明显正相关,与BALF中IL-4/IFN-γ亦呈明显正相关。SP-A与BALF IL-4/IFN-γ呈明显负相关。结论支气管哮喘使小鼠ATⅡ明显受损,KL-6表达增加,SP-A、SP-B表达下降。BUD、BCG干预可减轻哮喘ATⅡ的损伤。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的：建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）分离、纯化和培养技术,为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞（BASC）的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础。方法：采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AECⅡ,并进行原代培养。用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果：该方法所获得细胞产量大、纯度高。AECⅡ比例约为（80±2.6）%（n=5）,Clara细胞约（6.7±1.2）%（n=5）,并能维持培养3～5 d。透射电镜观察AECⅡ,细胞内可见板层小体。结论：该方法是一种可靠的小鼠AECⅡ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求。

Sirt1通过去乙酰化NF-κB/p65减轻小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞脂多糖损伤

目的研究酵母沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin type 1,Sirt1)在肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)脂多糖(LPS)损伤中对NF-κB的作用。方法购买Sirt1过表达(Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠,饲养、繁殖、鉴定新生小鼠基因型;通过qRT-PCR和Western blot鉴定Tg小鼠和WT小鼠肺组织Sirt1 mRNA和蛋白表达差异;两种不同Sirt1基因背景的小鼠LPS(15 mg/kg)腹腔注射12 h后,HE染色鉴定肺组织病理变化差异;分离纯化两种小鼠的AECⅡ并进行鉴定;两种不同Sirt1基因背景的AECⅡ用LPS 10μg/mL处理后,分别在0、2、4、6、8、12、24 h用ELISA检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平;用LPS 10μg/mL处理两种AECⅡ,同时设置生理盐水对照组,12 h后用Western blot鉴定细胞NF-κB/p65蛋白和乙酰化NF-κB/p65蛋白的表达差异。结果新生小鼠有Tg和WT两种不同的基因型;Tg小鼠肺组织Sirt1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于WT小鼠(P<0.05);小鼠腹腔注射LPS 15 mg/kg 12 h后肺组织病理变化显示,Tg小鼠较WT小鼠肺组织损伤程度轻;两种AECⅡ用LPS 10μg/mL处理后,细胞上清液中IL-6和TNF-α的表达水平随时间推移呈现逐渐升高的趋势,Tg组AECⅡ细胞上清液中IL-6和TNF-α的表达水平在多个时间点都显著低于WT组(P<0.05);两种AECⅡ经LPS(10μg/mL)处理后,与各自的空白对照组相比Sirt1含量下降,且WT组AECⅡ下降更明显,LPS处理后WT组AECⅡ的NF-κB/p65和乙酰化NF-κB/p65的变化倍数均高于Tg组。结论 Sirt1可能通过去乙酰化NF-κB/p65参与调控AECⅡLPS炎症损伤,抑制急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)小鼠肺部炎症反应。

布地奈德对哮喘小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

目的探讨布地奈德对哮喘小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响。方法40只昆明小鼠随机分为哮喘模型组(A组)、治疗对照组(B组)、布地奈德治疗组(C组)及正常对照组(D组),以卵蛋白致敏和激发制备哮喘小鼠模型,透射电镜下观察肺泡Ⅱ型细胞形态。结果A、B组小鼠可见肺泡Ⅱ型细胞板层小体有明显排空和空泡化改变,C组小鼠肺泡Ⅱ型细胞板层小体排空和空泡化改变减轻。结论布地奈德可减轻哮喘诱发的肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构损伤,肺泡Ⅱ型上皮细胞可能是抗哮喘治疗的一个重要作用靶点。

内毒素诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡不依赖TNF-α的研究

目的 :探讨内毒素 (脂多糖 ,LPS)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞 (AECⅡ )凋亡的分子机制 ,LPS介导的AECⅡ凋亡是否需要肿瘤坏死因子 α(TNF α)的参与。 方法 :采用文献方法加以修改而建立小鼠 (C5 7、TNFKO)AECⅡ体外培养模型 ,采用LPS和重组小鼠TNF α刺激细胞 2 4h后观察。用ELISA法测定细胞培养上清中TNF α水平 ,而细胞凋亡检测采用TNUEL法。 结果 :①LPS诱导AECⅡ细胞凋亡在C5 7野生型小鼠呈剂量依赖关系 ,LPS 5 0 μg/ml刺激时 ,细胞凋亡率为 (2 2 .7± 2 .1 ) % ,对照组为 (6 .4± 0 .9) % ,P <0 .0 5 ;②LPS在诱导AECⅡ凋亡的同时 ,诱导TNF α水平升高 1 1倍 ;③大剂量的重组TNF α并不能明显诱导AECⅡ凋亡 ;④在TNF基因剔除 (knockout,KO)小鼠 ,LPS仍可明显诱导AECⅡ凋亡。 结论 :①在体外培养条件下 ,LPS可明显诱导AECⅡ凋亡 ;②LPS刺激的TNF α释放并不参与LPS介导的AECⅡ凋亡 ;③LPS诱导的AECⅡ凋亡是通过TNF

大小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养方法

肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)是肺泡上皮细胞的"祖细胞",可分化为AECⅠ,其作用与肺组织的生理功能密切相关,获取AECⅡ将为肺部疾病的研究提供良好的实验模型和基础。大鼠和小鼠是常用的制备AECⅡ的动物,胎肺的消化方法和消化酶的种类、分离纯化的方法、鉴别的方法以及培养方法等是AECⅡ研究的重点和难点,虽然已经进行了广泛研究,但目前尚未形成一套完善的胎鼠AECⅡ分离、纯化与鉴定的方法。此外,AECⅡ的产量、纯度和传代等都是需要将来继续探索的问题。

小鼠胚胎成纤维细胞对体外培养肺泡上皮Ⅱ型细胞干性的维持作用

目的：探讨小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cell,MEF）作为滋养细胞对体外培养肺泡上皮Ⅱ型细胞（alveolar epithelial typeⅡcells,ATⅡ）干性的维持作用。方法：通过分散酶（Dispase）、分散酶/胶原酶（colleganse/disapase）和脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）联合消化小鼠肺组织,制备肺单细胞悬液,通过免疫黏附法纯化ATⅡ。高糖DMEM添加10%FBS、双抗（青霉素20 U/ml,链霉素20 U/ml）;将传代后的ATⅡ接种至丝裂霉素处理的MEF（inactivated MEF,i MEF）培养,并以肺泡表面活性蛋白C（surfactant protein C,SPC）和水通道蛋白5（aquaporins 5,AQP5）为标记蛋白进行鉴定。结果：平均每只成年小鼠可得到总有核细胞数为（1.7-2.0）×10^7。ATⅡ细胞传代接种于滋养细胞前3代都能维持在未分化状态,第4代分化成为肺泡上皮Ⅰ型细胞（alveolar epithelial typeⅠcells,ATⅠ）;而传代后没有接种在滋养细胞上的ATⅡ细胞在第1代就分化成ATⅠ细胞。结论：小鼠胚胎成纤维细胞在一定时段能够维持ATⅡ的干性。

人羊膜间充质干细胞对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子影响的研究

背景烟雾吸入性肺损伤在烧伤患者中较为常见,吸入的有毒气体、颗粒等易引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI),目前无特异性治疗方法。目的研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT-Ⅱ)增殖、凋亡及炎症因子的影响。方法采用酶消化法分离培养hAMSCs和AT-Ⅱ,采用流式细胞术和免疫荧光分别鉴定hAMSCs和AT-Ⅱ;松木屑烟雾溶液染毒AT-Ⅱ复制烟雾诱导的细胞损伤。实验细胞分为对照组(无血清DMEM/F12)、致伤组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒)和治疗组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒,hAMSCs与AT-Ⅱ共培养)。采用CCK-8检测细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;Elisa检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的表达。结果与对照组比较,致伤组AT-Ⅱ的活性降低(P<0.01),经hAMSCs治疗后,与致伤组比较,AT-Ⅱ细胞活性增加(P<0.01);致伤组细胞的凋亡率在12 h和24 h均增加(P<0.01),hAMSCs治疗后细胞凋亡率降低(P<0.01);细胞致伤后炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量增加(P<0.05),经hAMSCs共培养12 h和24 h后,促炎因子TNF-α和IL-6的表达均下调(P<0.05),IL-10含量增加(P<0.05)。结论hAMSCs可以促进松木屑烟雾溶液诱导的AT-Ⅱ增殖和抑制细胞凋亡,可能与调节炎症因子的表达有关,为探究hAMSCs治疗烟雾引起的急性肺损伤提供理论依据。

Ⅱ型肺泡上皮细胞来源外泌体miR-21-5p靶向SKP2缓解支气管肺发育不良

目的探讨来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC-Ⅱ)外泌体(exosomal,Exos)-miR-21-5p(简称miR-21)靶向S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)对支气管肺泡发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的保护效应及作用机制。方法使用60只6~8周龄的SD大鼠,其中30只通过差速贴壁离心法提取原代AEC-Ⅱ并进行培养。密度梯度离心法用于获得AEC-Ⅱ来源的外泌体,密度梯度离心法用于提取AEC-Ⅱ培养基中囊泡,并通过透射电镜及粒径分析对其验证,双荧光素报告基因实验以确认miR-21与SKP2的靶向关系。剩余的30只大鼠按照3∶1的雌雄比例混合,以便于进行怀孕检测。将这些新生小鼠随机分为4个不同的实验组:空气对照组(Con组)、高氧处理组(BPD+PBS组)、接受高氧和外泌体治疗的小鼠(BPD+Exos-miR-21组),以及高氧联合外泌体miR-21抑制剂处理组(BPD+Exos-AV-miR-21组)。新生SD大鼠将暴露于85%的氧气环境中,以此建立BPD模型。经过14 d高氧处理后,使用RTq-PCR技术检测肺组织和外泌体中miR-21的表达水平。肺组织经HE染色观察其病理学变化,并计算了平均肺泡线性截距(MLI)和放射状肺泡计数(RAC)。分光光度法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)的水平,荧光分光光度法测定活性氧簇(ROS)水平。此外,利用Western blot技术检测了SKP2、NR2F2和VEGF-A蛋白的表达水平。结果电镜及粒径分析结果显示AEC-Ⅱ细胞提取的小泡结构物质属于外泌体,miR-21在外泌体中表达显著上调(P<0.01),双荧光素酶基因报告实验证实SKP2为miR-21的作用靶标。与Con组比较,BPD+PBS组及BPD+Exos-AVmiR-21组肺组织HE可见肺组织结构紊乱,肺泡增大、简化,ROS、MDA、MLI增高及SKP2蛋白表达升高(P<0.01);而RAC、SOD、T-AOC、miR-21下调及NR2F2、VEGF-A蛋白表达降低(P<0.01);与BPD+PBS组比较,BPD+Exos-miR-21组肺组织HE可见无肺泡数目增加,肺泡简化程度好转,同时MLI、ROS、MDA降低及SKP2蛋白表达降低(P<0.01);而ROC、SOD、T-AOC、miR-21上调及NR2F2、VEGF-A蛋白表达升高(P<0.01)。结论AEC-Ⅱ来源的Exos-miR-21可能靶向SKP2通过促进NR2F2、VEGF-A蛋白表达抑制氧化应激促进肺泡发育改善BPD。

小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、原代培养及鉴定

目的:建立系统可靠的小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养、纯化及鉴定技术,为进一步研究肺纤维化及肺肿瘤等疾病的发病机制奠定基础.方法:应用低质量分数胰酶联合胶原酶的方法消化小鼠胎鼠肺组织块,经差速离心和差速贴壁的方法纯化肺泡Ⅱ型上皮,进行原代培养.用改良巴氏染色法和透射电镜观察对所分离的细胞进行鉴定.结果:每只胎鼠可获得(5±2)×106的细胞产量,细胞活力为95%±2%,纯度达到92%±2%,改良巴氏法镜下观察可见胞质内含较多深色颗粒,透射电镜观察到特征性的嗜锇小体即板层小体和细胞膜上有明显的微绒毛.结论:该方法能成功分离出小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,且产量大、纯度高,能满足体外研究的需要.

膜联蛋白A1拟肽AC2-26调控ERK/NF-κB信号通路改善体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤

目的探究AC2-26对体外循环(CPB)血清诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响及其作用机制。方法收集16例风湿性心脏病手术患者CPB停机后的无菌血液并分离血清,建立体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型。提取健康SD大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞,培养72 h后,随机分为5组即对照组(C组),肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)损伤组(M组),AC2-26+AECⅡ损伤组(A组),AECⅡ损伤+Boc2组(B组),AC2-26+AECⅡ损伤+Boc2组(A+B组)。CCK-8、流式细胞术检测各组细胞增殖、凋亡情况;免疫荧光检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞甲酰肽受体2(FPR2)和肺泡表明活性物质(SPC)表达情况;透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体的影响;Western blot检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞ERK、NF-κB表达情况。结果应用AC2-26后,CPB血清诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖率明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05),AC2-26明显抑制ERK及NF-κB蛋白的磷酸化(P<0.05),促进SPC的表达,改善细胞内板层小体结构及形态,这一现象可被甲酰肽受体抑制剂Boc2阻断。结论AC2-26可以减轻CPB血清诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤,其作用机制可能与FPR2调节ERK、NF-κB信号通路有关。

重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用及乌司他丁干预的实验研究

目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中其肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用并对乌司他丁对其干预的作用进行分析。方法将42只健康大鼠随机分为3组,分别为假手术组、模型组与乌司他丁干预组,每组14只,以向大鼠十二指肠乳头内侧胰胆管注射脱氧胆酸钠建立SAP大鼠模型,假手术组大鼠仅打开大鼠腹腔轻轻翻动其胰腺后关闭腹腔,乌司他丁干预组于大鼠建模后给予乌司他丁注射。对几组大鼠术后肺组织及胰腺组织的病理变化及相关指标差异进行分析。结果与假手术组比较,SAP组及乌司他丁干预组TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更高,乌司他丁干预组与SAP组比较,TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更低(P<0.05)。SAP大鼠伴随着明显的肺损伤状况,假手术组、SAP组、乌司他丁干预组肺湿/干比值分别为3.62±0.56、6.48±0.77、4.69±0.63,血气指标PaCO_(2)、PaO_(2)分别为(31.25±1.03)mmHg、(106.52±2.03)mmHg,(48.67±2.01)mmHg、(73.57±2.44)mmHg和(35.22±1.32)mmHg、(90.22±3.01)mmHg),SAP组及乌司他丁干预组大鼠肺湿/干比值及PaCO_(2)明显上升,PaO_(2)明显下降,相较于SAP组,乌司他丁干预组大鼠的肺湿/干比值及PaCO_(2)更低,PaO_(2)更高(P<0.05)。假手术组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率[(3.58±0.57)%]及Ca^(2+)浓度[(34.52±2.35)%]均显著低于SAP组凋亡率[(29.67±4.52)%]及Ca^(2+)浓度[(82.66±4.66)%]及乌司他丁干预组凋亡率[(14.62±3.67)%]及Ca^(2+)浓度[(46.77±5.02)%],乌司他丁干预组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率及Ca^(2+)浓度显著低于SAP组(P<0.05)。假手术组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达均显著低于SAP组及乌司他丁干预组,乌司他丁干预组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达显著低于SAP组(P<0.05)。SAP肺损伤大鼠线粒体细胞破坏明显,乌司他丁对减少线粒体细胞破坏数量具有明显作用。结论SAP肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了其作用机制,TNF⁃α、AMY、MDA、Caspasee⁃8、BaxmRNA在肺损伤机制中存在重要作用,乌司他丁干预有利于缓解SAP肺损伤状况,有利于控制病情进展。

右美托咪定通过调控白细胞介素-17及转化生长因子-β1/Smad蛋白3信号通路对脂多糖诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨右美托咪定介导白细胞介素(IL)-17对脂多糖(LPS)诱导的人Ⅱ型肺泡上皮A549细胞(以下简称“A549细胞”)炎症、增殖、迁移、上皮间质转化及转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad蛋白3(Smad3)信号通路的调控作用。方法体外培养A549细胞,将其分为对照组(不做干预)、LPS组(10.00μg/ml LPS)和实验组(10.00μg/ml LPS+1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml右美托咪定),分别采用CCK-8试剂盒和反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定细胞活力和IL-17 mRNA表达水平以筛选右美托咪定最适实验浓度;随后将细胞分为对照组、LPS组、IL-17组、右美托咪定组和IL-17+右美托咪定组,干预24 h。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子IL-17、IL-8和IL-6的表达水平;5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)试剂盒用来检测细胞增殖率;划痕实验用来检测细胞迁移率;蛋白免疫印迹(WB)法测定肺泡上皮间质转化(EMT)相关蛋白、TGF-β1/Smad3通路相关蛋白及IL-17蛋白表达水平。结果右美托咪定逆转了LPS对A549细胞活力的抑制作用和IL-17 mRNA表达水平的促进作用,且10.00μg/ml浓度的右美托咪定组的效果最好,因此选择10.00μg/ml右美托咪定用于后续实验。LPS组细胞中IL-17、IL-8、IL-6表达水平、细胞迁移率、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维粘连蛋白(FN)、Smad3的磷酸化(p-Smad3)/Smad3、TGF-β1和IL-17蛋白表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);LPS组细胞增殖率、E-钙黏蛋白和Smad7蛋白表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-17+右美托咪定组IL-17、IL-8、IL-6表达水平、细胞迁移率、N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN、p-Smad3/Smad3、TGF-β1和IL-17蛋白表达水平低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);IL-17+右美托咪定组细胞增殖率、E-钙黏蛋白和Smad7蛋白表达水平高于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论右美托咪定通过抑制IL-17的分泌恢复LPS诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤,促进LPS诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖并抑制其迁移和EMT进程,其作用机制与抑制TGF-β1/Smad3通路的信号转导有关。

构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法

目的建立可靠稳定的小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)的分离、原代培养技术,为进一步研究AECⅡ转分化分泌生长转化因子β1(TGF-β1)等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。方法采用传统的方法和改良后方法分别提取20只小鼠AECⅡ,将其所提取的细胞数量进行对比。结果传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个,改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个,差异有统计学意义(P<0.05),而两组小鼠在体质量、年龄以及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论此改良方法可成功获得大量稳定的AECⅡ,为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。