假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的表位及中和活性的研究

目的通过ELISA相加试验和狂犬病毒(Rabies virus,RV)逃逸突变试验对一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(human anti-rabies virus monoclonal antibody,Ab1)进行抗原表位分析。方法将已知表位的对照抗体(CR57和CR4098)和Ab1进行ELISA相加试验;以及对RV逃逸株氨基酸突变位点分析进一步验证Ab1针对的抗原表位,用小鼠中和试验(mouse neutralization test,MNT)分析Ab1的体内抗狂犬病病毒中和活性。结果Ab1和CR57可同时与RV结合;与CR4098存在竞争,Ab1的逃逸株在氨基酸位点333、336发生突变,MNT检测体内中和活性为550.32 IU/mg,MNT和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)结果基本一致。结论该抗体针对III号抗原表位且具有较高的抗狂犬病病毒中和活性。

狂犬病病毒糖/核蛋白“二价”DNA疫苗田间免疫效果评定

以狂犬病病毒糖、核蛋白'二价'DNA疫苗pVGN免疫3月龄至8岁龄家犬302条,分为2组:Ⅰ组201条,两侧股内侧肌注;Ⅱ组101条,单侧股内侧肌加单侧耳廓皮内联合注射.免疫3次,剂量为每条犬每次300μg,于试验的0d和35d分别进行.三免后21d用间接ELISA检测特异性抗体,Western-blot分析抗体组成,间接免疫荧光和小鼠中和试验测定抗体中和效价.结果显示,三免后抗体阳转率为58%,组间抗体水平差异不显著(P＞0.05),机体产生了抗糖蛋白、核蛋白2种特异性抗体,抗体稀释8～512倍后,每50μL可以中和100TCID50狂犬病病毒SRV9,个别稀释到2048倍仍具有中和作用,抗体稀释8～16倍后每15μL可中和120MICLD50狂犬病病毒CVS,少部分犬三免后抗体稀释16～32倍后能中和300MICLD50狂犬病病毒CVS.说明该疫苗具有良好的免疫原性,且诱生的抗体能发挥病毒中和作用.

A型肉毒抗毒素ELISA方法的建立及验证

目的:建立定量检测A型肉毒抗毒素效价的酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行验证。方法:以A型肉毒类毒素为包被抗原包被酶标板,封闭后加入稀释的血清样品,以辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG(IgG-HRP)作为酶标抗体,加入四甲基联苯胺显色剂(TMB)显色10~15 min, 2 mol·L^(-1)硫酸终止反应,于酶标仪上读取A_(450 nm)值,以标准曲线样品浓度的对数(X)为横坐标,A_(450 nm)值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,将待测血清样品A_(450 nm)值代入曲线方程即可得到血清样品浓度,乘以稀释倍数即为血清样品效价。结果:在优化的条件下,该方法具有较高的特异性,除了与A型肉毒抗毒素血清反应外,对B、C、D、E、F型肉毒抗毒素血清均无交叉反应;在线性范围50~400 mIU·mL^(-1)时线性关系良好,r>0.990 0;准确度介于80%~120%;精密度(重复性和中间精密度)RSD<20%;采用该方法测定20批A型肉毒抗毒素血清的效价范围在525~2 450 IU·mL^(-1),中和试验法检测范围在675~2 400 IU·mL^(-1),二者的相关系数r=0.906 0(P<0.001),呈显著性正相关。结论:建立的ELISA定量检测方法在实验室条件下可以取得稳定的结果,为A型肉毒抗毒素效价的测定提供了一种简便的体外检测方法。