高脂饮食联合血管紧张素-Ⅱ和β-氨基丙腈构建小鼠主动脉夹层模型

目的探索应用高脂饮食联合血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)和β-氨基丙腈(BAPN)构建小鼠主动脉夹层模型的方法。方法24只C57BL/6J小鼠(4周龄,雄性)分为对照组[腹腔注射0.9%氯化钠注射液10 ml/(kg·d)]、Ang-Ⅱ4 mg/(kg·d)组和Ang-Ⅱ4 mg/(kg·d)+BAPN 0.33 g/(kg·d)组,每组8只;每只小鼠均给予高脂饮食,同一时间点测量小鼠体质量并按体质量标准给药,实验过程中死亡小鼠立即解剖,取出主动脉行病理切片并在显微镜下观察。给药期间采用小动物超声观察主动脉形态,对有明显夹层形成的小鼠直接处死并解剖。结果给药后,高脂饮食联合Ang-Ⅱ+BAPN组小鼠活动量、食欲下降最为明显,且比高脂饮食联合Ang-Ⅱ组小鼠主动脉夹层破裂病死率和建模成功率高,对照组小鼠未见明显变化。在小动物超声下,高脂饮食联合Ang-Ⅱ+BAPN组对比其他两组小鼠可见腹主动脉血管假腔形成,血管膨大。将实验组小鼠给药过程中死亡的小鼠立即解剖,可见腹腔及血管周围大量的血凝块;小动物超声下见主动脉夹层或主动脉瘤形成的小鼠,解剖可见血管壁与周围组织粘连严重,而对照组小鼠血管未见明显异常。HE染色结果显示,高脂饮食联合Ang-Ⅱ+BAPN组小鼠有血管壁假腔形成,弹力蛋白和胶原蛋白排列紊乱。统计每组血管壁厚度,分析发现两个实验组均比对照组的血管增厚,差异有统计学意义(P<0.001)。Ang-Ⅱ+BAPN联合高脂饮食组小鼠的血管壁出现了严重的弹性蛋白分解。结论通过高脂饮食联合Ang-Ⅱ4 mg/(kg·d)+BAPN 0.33 g/(kg·d)可以建立高效的小鼠主动脉夹层模型。

流式细胞术检测小鼠主动脉组织中炎性反应细胞浸润的方法研究

目的应用剪碎和混合酶消化法,建立一种有效的用于流式细胞术分析的小鼠血管组织单细胞悬液,用于检测血管紧张素Ⅱ刺激引起的血管组织中炎性细胞的浸润。方法采用皮下微量泵持续泵入血管紧张素Ⅱ(1 000 ng·kg-1·min-1),于灌注3 d后将小鼠麻醉后立即处死,取出胸主动脉和腹主动脉,迅速剪碎,用混合酶消化小鼠血管组织,制备单细胞悬液,用于流式细胞技术检测。结果每只小鼠血管组织分离细胞数可达5×105个/m L;光镜下单细胞悬液细胞完整透明,分散排列,状态良好;流式细胞术检测显示血管紧张素Ⅱ处理后明显增加了血管组织中中性粒细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的数量。结论应用剪碎和混合酶联合消化法制备小鼠血管组织单细胞悬液简便可行,为血管炎性细胞浸润的研究提供了有效的组织单细胞悬液制备方法。

蜂胶乙醇提取物对小鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的:探究蜂胶乙醇提取物(ethanol extracts of propolis,EEP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠主动脉内皮细胞(mouse aortic endothelial cell,MAEC)炎症因子损伤的保护作用。方法:将细胞分为对照组,LPS模型组,蜂胶低(2.5μg/mL)、中(5μg/mL)、高(10μg/mL)剂量组。采用CCK-8检测MAEC的细胞增殖率,ELISA酶联免疫吸附实验测定MAEC炎症细胞中TNF-α、IL-6的含量,Western Blot法测定MAEC炎症细胞中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表达水平。结果:与对照组相比,LPS组MAEC的细胞增殖率极其显著降低(P<0.001),ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α以及IL-6的水平极其显著升高(P<0.001)。经不同浓度EEP处理后,MAEC的细胞增殖率显著上升(P<0.05或P<0.01),TNF-α、IL-6的含量以及ICAM-1、VCAM1、MCP-1表达水平降低,各蜂胶组与LPS组相比均有显著性差异(P<0.01或P<0.001)。结论:EEP能够抑制LPS诱导的MAEC中炎症因子的表达,对血管内皮细胞具有保护作用。

载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠整装(whole-mount)主动脉免疫荧光组织化学染色的血管外膜淋巴管成像

目的 探索载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠整装(whole-mount)主动脉免疫荧光组织化学染色法显示血管外膜淋巴管的可行性。方法 制备ApoE^(-/-)小鼠整装主动脉,进行淋巴管内皮受体1(LYVE1)、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光组织化学染色,染色后组织经5 g/L苏丹黑B处理30 min、组织透明液透明,移至自制的样本容器中,荧光显微镜下成像。结果经5 g/L苏丹黑B处理的整装主动脉可见血管自发荧光显著降低,外膜淋巴管的特异性荧光强度显著增强,更易观察且不会对其他通道荧光产生干扰。结论 建立的ApoE^(-/-)小鼠整装主动脉免疫荧光组织化学染色显示血管外膜淋巴管的方法操作简便,特异性好。

生长分化因子11对软脂酸诱导小鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的探索生长分化因子11 （GDF-11）对软脂酸（PA）诱导的小鼠主动脉内皮细胞（MAECs）的作用及其相关机制。 方法通过加或不加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）或Smad3抑制剂SIS3研究eNOS和Smad通路在GDF-11保护软脂酸诱导的MAECs中的作用，将MAECs分为：（1）对照组；（2）PA组；（3）PA＋GDF-11组；（4）PA＋GDF-11＋L-NAME组；（5）PA＋GDF-11＋SIS3组，培养24 h后，活性氧试剂盒及实时-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测各组细胞氧化应激水平；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；Western blotting法检测各组抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax及Cleaved-caspase3蛋白表达水平。研究GDF-11对MAECs Smad信号通路的影响，MAECs分为：（1）对照组；（2）GDF-11组；（3）GDF-11＋转化生长因子β（TGF-β）受体Ⅰ抑制剂组（GDF-11＋ SB431542组），培养30 min后，免疫荧光染色法检测各组MAECs细胞磷酸化Smad2/3 （P-Smad2/3）表达水平；研究GDF-11对MAECs AMPK/eNOS信号通路的影响，MAECs分为：（1）对照组；（2）GDF-11组；（3） GDF-11＋AMPK抑制剂Compound C组；（4）GDF-11＋L-NAME组；（5）GDF-11＋Compound C＋L-NAME组，培养30 min后，Western blotting法检测各组细胞AMPK、磷酸化AMPK （P-AMPK）、eNOS、磷酸化eNOS （P-eNOS）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt （P-Akt）、蛋白激酶A （PKA）、磷酸化PKA （P-PKA）水平。多组之间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用最小显著性差异t检验。 结果与对照组相比，PA组细胞氧化应激和凋亡率显著增加（28.9%±2.2％比7.9%±1.5%），PA＋GDF-11组细胞氧化应激和凋亡率明显低于PA组（12.6%±1.6％比28.9%±2.2%），而PA＋GDF-11＋L-NAME组和PA＋GDF-11＋SIS3组细胞氧化应激和凋亡率又明显低于PA＋GDF-11组（分别为21.8%±2.0%、20.1%±1.8%、12.6%±1.6%，F= 97.89，P〈0.05）。与对照组相比，GDF-11组P-Smad2/3表达水平明显增加，而GDF-11＋SB431542组P-Smad2/3表达水平明显降低（F=325.30 ，P〈0.05）。与对照组相比，GDF-11组P-AMPK/AMPK、P-eNOS/eNOS水平显著提高，P-Akt/Akt、P-PKA/PKA水平无明显差异，分别加入了Compound C、L-NAME或者Compound C联合L-NAME显著抑制了P-AMPK/AMPK、P-eNOS/eNOS表达水平（F=237.65、281.08，均P〈0.05），而对P-Akt/Akt、P-PKA-PKA水平无明显影响（F=1.94、1.48，均P〉0.05）。 结论GDF-11可抗软脂酸诱导的MAECs氧化应激和凋亡，增加Bcl-2表达水平、降低Bax、Cleaved-caspase3表达水平，其保护内皮细胞的机制与激活TGF-β/Smad和AMPK/eNOS信号途径有关。

氯沙坦对载脂蛋白E基因缺陷小鼠氧化应激及动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂氯沙坦对载脂蛋白E基因缺陷小鼠氧化应激及主动脉粥样斑块中血管平滑肌细胞、巨噬细胞数量影响,探讨氯沙坦稳定斑块的作用及可能机制。方法27只8周龄雄性载脂蛋白E基因缺陷小鼠随机等分三组:对照组、氯沙坦低剂量组[5 mg/(kg.d)]及氯沙坦高剂量组[25 mg/(kg.d)],20周后处死动物。常规生物化学法测定血清一氧化氮含量、超氧化物歧化酶活性、丙二醛及血脂水平;采用HE染色法观察小鼠主动脉粥样硬化病变形成;免疫组织化学法分析粥样斑块中血管平滑肌细胞和巨噬细胞数量。结果三组间血脂水平无显著性差异;与对照组相比,氯沙坦低、高剂量组血清一氧化氮水平和超氧化物歧化酶活性均明显升高(P<0.01)、丙二醛水平显著减低(P<0.05和P<0.01),且氯沙坦低剂量和高剂量组间也有明显差异(P<0.01);氯沙坦干预后动脉粥样斑块纤维帽厚,脂质核心小;氯沙坦治疗组斑块中平滑肌细胞数量显著增加(P<0.01)、巨噬细胞数量明显降低(P<0.01),且氯沙坦高剂量组较低剂量组作用更明显(P<0.01)。结论氯沙坦在不影响血脂水平情况下,可通过减轻载脂蛋白E基因缺陷小鼠氧化应激,增加斑块中平滑肌细胞数量,降低巨噬细胞数量,可能起到稳定粥样斑块作用,且随剂量增加作用增强。

穹窿主体蛋白对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :探讨穹窿主体蛋白(major vault protein,MVP)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响。方法:分离培养野生型小鼠VSMCs,用血小板源性生长因子(PDGF-BB)或15%胎牛血清(FBS)刺激VSMCs增殖,Western blot检测VSMCs的MVP表达水平,同时检测特异性分化标记物α-SMA和SM22α表达水平。然后用PDGF-BB刺激人主动脉平滑肌细胞(HAo SMCs),检测MVP的表达差异。再分别分离培养野生型小鼠和MVP敲除型小鼠的VSMCs,通过CCK8细胞增殖实验检测两者的增殖能力;同时用si RNA干扰的方法,使HAo SMCs中MVP低表达,检测其增殖能力的变化。结果:用PDGFBB或15%FBS刺激VSMCs后,MVP表达水平呈浓度和时间依赖性下降,α-SMA和SM22α表达水平也相应降低。MVP缺失或低表达情况下,VSMCs的增殖能力均下降。结论:MVP在VSMCs增殖中起了重要作用。

三七皂苷R1对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响

目的研究三七皂苷R1(NR1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉血管平滑肌(MOVAS)细胞增殖、迁移的影响。方法将MOVAS细胞分为Control组、NR1组、AngⅡ组、AngⅡ+NR1组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测MOVAS细胞的增殖活性,采用Transwell小室和划痕愈合实验检测MOVAS细胞纵、横向迁移能力。观察NR1对AngⅡ诱导MOVAS细胞增殖、迁移的影响。结果MOVAS细胞经AngⅡ(5μM)作用后,其增殖活性、纵、横向迁移能力明显增加,与Control组相比差异有统计学意义(P<0.01);而加NR1(50μM)干预后,AngⅡ+NR1组细胞增殖活性降低、纵、横向迁移能力均下降,与AngⅡ组相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论NR1可抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移,这可能是NR1预防和治疗动脉粥样硬化及血管再狭窄等血管增生性疾病的作用机制之一。

ATG5介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖

目的探究ATG5介导人脐静脉内皮细胞外泌体对小鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法利用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注消化法获得原代人脐静脉内皮细胞;利用组织块贴壁法分离原代小鼠胸主动脉平滑肌细胞;利用超速离心法提取内皮细胞外泌体;利用共聚焦高内涵成像分析仪示踪平滑肌细胞摄取内皮细胞外泌体;利用siRNA干扰内皮细胞ATG5蛋白表达;利用高内涵DPC成像模式分析平滑肌细胞增殖能力。结果成功得到活性好、纯度高的人脐静脉内皮细胞和小鼠胸主动脉平滑肌细胞。超速离心法获得的内皮细胞外泌体经免疫印迹鉴定,呈Hsp70、TSG101、CD9和CD63阳性。高内涵示踪结果显示平滑肌细胞在共培养30 min后开始摄取内皮细胞外泌体,共培养4 h后,平滑肌细胞摄取的外泌体明显增多。高内涵监测结果显示,与对照组比较,ATG5干扰组内皮细胞分泌的外泌体在浓度为200μg/ml时能够明显抑制平滑肌细胞的增殖。结论ATG5可通过介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖。

间充质干细胞治疗小鼠放射性肺损伤的病理学研究

目的 观察骨实质间充质干细胞及小鼠胚胎背主动脉（dorsal aorta,DA）区间充质干细胞对小鼠肺损伤的治疗作用.方法 将C57BL/6小鼠分为4组：正常对照组、肺照射组、骨片来源MSCs治疗组和胚胎背主动脉区来源MSCs治疗组.9个月后观察肺组织结构的病理变化.结果 小鼠肺纤维化及肺泡炎评分,正常组评0.17分、肺照射组评2分、胚胎背主动脉区MSCs治疗组评1分、骨片MSCs治疗组评1.38分,在骨片来源MSCs治疗组及胚胎背主动脉区来源MSCs治疗组均较肺照射组轻,由于例数少,未做统计分析.结论 无论是骨片来源还是胚胎背主动脉来源的MSCs,均有减轻放射性肺损伤的作用.