植物雌激素大豆黄酮对小鼠乳腺上皮细胞乳成分合成和细胞增殖的影响及机制

本试验旨在研究植物雌激素大豆黄酮(daidzein, DZ)对小鼠乳腺上皮细胞EpH4-Ev乳糖、乳蛋白、乳脂肪合成及细胞增殖的影响,探讨相关的调节作用。首先用不同浓度DZ(0~1 000μmol·L^(-1))处理EpH4-Ev细胞6、12、24、48 h,通过检测细胞活力确定DZ作用浓度及时间;试验分为对照组(0μmol·L^(-1) DZ处理)、低浓度组(10μmol·L^(-1) DZ处理)、中浓度组(20μmol·L^(-1) DZ处理)、高浓度组(40μmol·L^(-1) DZ处理),并以生理剂量的雌二醇(E2)作为阳性对照,37℃、5%CO_(2)培养12 h后,进行如下试验:(1)测定细胞及分泌上清中甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)含量及脂滴染色变化;(2)检测细胞增殖与凋亡相关蛋白、乳成分合成相关蛋白的表达变化;(3)检测PI3K/AKT-mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化水平;(4)流式细胞技术分析细胞凋亡率与细胞周期分布情况。结果显示:(1)与对照组相比,2.5~80.0μmol·L^(-1 ) DZ处理后,细胞活力极显著提高(P<0.01),其中20μmol·L^(-1 )DZ处理提高效果最为显著,结合实验室前期结果,选择DZ作用的低、中和高浓度分别为10、20和40μmol·L^(-1),作用时间为12 h。(2)与对照组相比,中浓度及高浓度组DZ及E2处理后极显著提高了EpH4-Ev细胞及分泌上清中TG和GLU的含量,促进了脂滴的合成(P<0.01)。(3)与对照组相比,不同浓度DZ处理后葡萄糖转运载体1(GLUT1)和β-酪蛋白(β-casein)的表达均极显著升高(P<0.01),同时DZ及E2处理后均提高脂肪酸合成酶(FASN)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达。(4)与对照组相比,不同浓度DZ及E2处理后均增加了G2/M期和S期的细胞占比,上调了增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1、D3、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,同时中浓度DZ组极显著增加了Bcl-2/Bax比值(P<0.01),细胞凋亡率降低。(5)三个浓度DZ及E2处理后均上调了PI3K/AKT-mTOR信号通路中p-PI3K、p-mTOR、p-AKT的磷酸化水平。结果表明:DZ处理可促进乳腺上皮细胞的增殖及乳成分的合成。其机制与上调细胞增殖蛋白的表达、降低细胞凋亡率,激活PI3K/AKT-mTOR通路有关。

大麻二酚对脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应和凋亡的抑制作用

[目的]研究大麻二酚(CBD)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠乳腺上皮细胞(HC11)炎症反应及细胞凋亡的影响。[方法]试验将HC11细胞分为对照组、LPS组和不同浓度CBD+LPS共处理组(CBD浓度分别为2、4、6μmol/L)。对照组细胞仅加入培养液,LPS组加入LPS处理,CBD+LPS共处理组用不同浓度CBD预处理1 h后加入LPS,24 h后收集各组细胞样品。利用ELISA法检测细胞中炎症因子含量;使用实时荧光定量PCR、Western blotting分别检测细胞炎症因子及核因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达水平;通过AnnexinV-FITC/碘化丙啶(PI)和JC-1染色法分别检测细胞凋亡率和线粒体膜电位水平。[结果]与对照组相比,LPS组细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6含量及mRNA表达水平均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),NF-κB p65、核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)、细胞外信号调节激酶(ERK)、丝裂原活化蛋白激酶(p38)、应激活化蛋白激酶(JNK)的mRNA表达量和蛋白磷酸化水平极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05)。与LPS组相比,不同浓度CBD与LPS共处理后细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量及mRNA表达量均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05),NF-κB p65、IκBα、ERK、p38、JNK的mRNA表达量和蛋白磷酸化水平均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05)。细胞凋亡率和线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,LPS组HC11细胞凋亡率显著升高(P<0.05),线粒体膜电位显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,4μmol/L CBD和LPS共处理后,HC11细胞凋亡率显著降低(P<0.05),线粒体膜电位显著升高(P<0.05)。[结论]在LPS诱导的小鼠HC11细胞炎症及凋亡模型中,适宜浓度CBD能抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活,从而抑制炎症因子的释放来缓解炎症反应;同时能降低LPS诱导的HC11细胞凋亡率、上调细胞线粒体膜电位,从而抑制细胞凋亡发生。

大肠杆菌感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制研究

旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制。本试验以奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺为研究对象,按试验要求分别随机分成3组:空白对照(Control)组、大肠杆菌(E.coli)组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组。Control组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺未被E.coli感染;E.coli组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺被感染复数为5或106 CFU的E.coli感染6或24 h,LPS组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺经1μg·mL^(-1)或20 mg·kg^(-1)体重LPS处理6或24 h,奶牛乳腺上皮细胞每组3个重复,小鼠乳腺每组6只小鼠。结果表明:1)奶牛乳腺上皮细胞胞浆中角18蛋白被染成绿色且均匀分布在细胞浆内,细胞核被DAPI染成蓝色。2)正常培养的奶牛乳腺上皮细胞内线粒体结构完整,细胞连接紧密;经E.coli感染的奶牛乳腺上皮细胞细胞间隙增大,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失且部分模糊消失。3)E.coli感染或LPS处理使小鼠乳腺腺泡内出现中性粒细胞,且使奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢(D(520 nm)吸光值、ATP的含量、线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低)、线粒体的融合与分裂(Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn 2和OPA 1 mRNA表达减少)和线粒体的生物发生(PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表达下降)极显著降低(P<0.05,P<0.01)。上述研究表明,E.coli感染主要通过LPS造成奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢紊乱、抑制线粒体分裂与融合以及减少线粒体的生物发生,进而造成线粒体损伤,最终导致乳腺炎的发生。因此,确认E.coli感染是通过诱导线粒体损伤造成奶牛乳腺炎,且线粒体损伤可能是造成乳腺损伤的重要原因之一。

不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取5种与泌乳相关的中药(王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦)研究其对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测,并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明,通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达,王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳,其机理尚待进一步研究。

中草药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响

【目的】研究中草药单味及复方提取物对原代培养的小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响,旨在为探明中草药治疗奶牛乳腺疾病机制提供试验依据。【方法】采用组织块种植法培养3月龄、分娩后3-5 d的昆明种远交系小白鼠的乳腺组织,采用胰蛋白酶消化法获得相对纯化的小鼠乳腺上皮细胞,并运用SDS-PAGE法进行鉴定。制备5味中草药（重楼、紫花地丁、木芙蓉、半枝莲、泽兰叶）及治疗奶牛乳房炎用中草药复方提取物,分别作用于对数生长期的乳腺上皮细胞5 d,用四甲基偶氮唑盐法（MTT法）分析细胞活力。【结果】将通过组织块种植法与胰蛋白酶消化法相结合,可得到纯化的有酪蛋白分泌功能的乳腺上皮细胞;中草药重楼、紫花地丁、木芙蓉、半枝莲、泽兰叶提取物在其质量浓度分别为8,40,40,1.6,8 mg/mL时,对小鼠乳腺上皮细胞增殖作用最强;除了紫花地丁,其他4种中草药提取物在其质量浓度为200 mg/mL时,对小鼠乳腺上皮细胞增殖的抑制作用最强。中草药复方提取物质量浓度为8~200mg/mL时,对小鼠乳腺细胞有显著促进作用,随着质量浓度的增加,促增殖作用减弱。【结论】中草药单味及复方提取物在一定质量浓度下对乳腺上皮细胞增殖产生了促进或抑制作用,且中草药复方提取物的适用质量浓度范围较广。

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景:目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高。目的:观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养。方法:采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1:1:1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养。结果与结论:倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应。说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。

小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展

综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。

顺9,反11-共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子的影响

比较不同浓度顺9,反11-共轭亚油酸(c9,t11-CLA)的抗炎作用。以奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为模型,添加确定对细胞增殖无影响的浓度梯度的c9,t11-CLA,检测炎症因子TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)、IL-10(白细胞介素-10)含量及TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA表达量的影响。与对照组相比,添加200μmol/L c9,t11-CLA显著降低BMECs中IL-8和TNF-α含量以及mRNA表达量(P<0.05),添加100μmol/L c9,t11-CLA显著增加TNF-α含量和IL-8的mRNA表达量(P<0.05)。试验结果表明,200μmol/L c9,t11-CLA对BMECs中促炎因子有抑制作用,可为后续c9,t11-CLA的抗炎机制研究奠定数据基础。

两种不同消化法对小鼠乳腺上皮细胞培养的影响

为了探究体外培养小鼠乳腺上皮细胞的消化方法,体外分离小鼠乳腺组织,分别采用胶原酶和胰蛋白酶混合消化法或两步消化法消化小鼠乳腺组织,并进行细胞培养,利用角蛋白18激光共聚焦显微技术鉴定目的细胞。结果显示,混合酶消化法能在短期内分离到大量的乳腺上皮细胞,且细胞纯度达到98%,细胞可连续培养至第3代;两步酶消化法虽能分离到一定量的乳腺上皮细胞,但细胞继代培养困难,且细胞不易纯化。以上结果表明,混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞优于两步酶消化法。

稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

小鼠和奶牛乳腺上皮细胞的分离及培养特性比较

为建立小鼠乳腺上皮细胞(MMECs)及奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)分离培养体系,并比较其生长特性。分别无菌采集健康妊娠后期昆明鼠及泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用改良混合酶消化结合差速贴壁法分离原代MMECs及BMECs,并进行细胞角蛋白18的免疫荧光鉴定;通过细胞形态跟踪观察评价传代、冻存和复苏后MMECs及BMECs生物学特性;连续培养及细胞计数绘制MMECs及BMECs生长曲线。结果显示,从小鼠和奶牛乳腺组织分离的目的细胞,经角蛋白18免疫荧光鉴定证实为MMECs及BMECs;汇合的单层MMECs多角形,呈铺路石样外观,BMECs呈鹅卵石样;MMECs在传至第2代时细胞特有形状消失,而BMECs传至第9代时仍保持其鹅卵石样外观;MMECs只能复苏冻存原代细胞,传代BMECs均可冻存和复苏。采用改良混合酶消化结合差速贴壁法可获得高纯度的MMECs和BMECs,两种细胞在生长培养特性上存在显著差异。

辛酸钠对小鼠乳腺上皮细胞甘油三酯合成的影响

以体外培养的小鼠乳腺上皮细胞为模型，研究辛酸钠对细胞甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）合成能力及其对甘油三酯合成的关键酶甘油-3-磷酸脂酰转移酶（GPAM）、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6（AGPAT6）、二酰甘油脂酰转移酶1（DGATl）和转录调节因子固醇调节元件结合蛋白1（SREBPl）及过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPARγ）基因表达影响。采用CASY细胞分析仪检测细胞活力和增殖能力；甘油三酯定量试剂盒检测培养液中甘油三酯浓度：Westernblotting检测GPAM、AGPAT6、DGAT1、SREBP1和PPARγ蛋白相对表达水平。结果表明：与对照组相比，2、4和8mmol·L^-1的辛酸钠能显著抑制小鼠乳腺上皮细胞活力和增殖能力；0．25～1mmol·L^-1的辛酸钠显著降低培养液中甘油三酯的浓度；0．25-1．0mmol·L^-1的辛酸钠以浓度依赖方式降低或显著降低GPAM、AGPAT6和DGAT1蛋白水平，并能显著降低SREBPl和PPARγ的蛋白表达。结果显示，辛酸钠能抑制小鼠乳腺上皮细胞甘油三酯合成，并对乳脂合成关键酶及转录调节因子的表达具有抑制作用。

β-谷甾醇对脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应及乳蛋白合成的影响

本试验旨在探讨β-谷甾醇(BSS)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠乳腺上皮细胞(HC11细胞)炎症反应及乳蛋白合成的影响。以体外培养的HC11细胞为模型,分为5组,对照组(生长培养基处理)、乳腺炎症模型组(LPS组,1μg/mL LPS处理)以及炎症模型药物组(BSS+LPS组,分别用5、10、20μmol/L的β-谷甾醇预处理1 h后加入1μg/mL LPS),每组设置5个重复。检测炎性细胞因子和乳蛋白mRNA表达以及乳蛋白合成信号通路相关基因mRNA和蛋白表达。结果表明:1)与对照组相比,LPS组的HC11细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。2)与对照组相比,LPS组的HC11细胞β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)和乳清蛋白(LALBA)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞CSN2、CSN3和LALBA的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。3)与对照组相比,LPS组的HC11细胞信号转导和转录激活因子5(STAT5)、酪氨酸激酶2(JAK2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)和核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),同时磷酸化信号转导和转录激活因子5(p-STAT5)、磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1和S6K1的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),同时p-STAT5、p-JAK2和p-mTOR的蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。由此可见,β-谷甾醇能够抑制LPS诱导的HC11细胞炎症反应和促进乳蛋白的合成。

小鼠乳腺上皮细胞的体外培养

采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶混合(1∶1∶1)消化乳腺组织,并用差速贴壁法纯化培养乳腺上皮细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态,并用角蛋白18免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定。结果表明:改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且12 h后细胞团绝大多数已贴在细胞瓶壁,72h后细胞团完全铺开呈单层融合,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光鉴定结果显示,角蛋白18呈阳性反应。因此,应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。

顺9,反11-共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞氧化应激损伤的影响研究

试验旨在研究顺9,反11-共轭亚油酸(c9,t11-CLA)对H_(2)O_(2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的保护作用。将分离纯化后的BMECs用不同的H_(2)O_(2)浓度和作用时间培养,以建立细胞氧化损伤模型;再在培养基中添加不同浓度(0、200、400、600、800μmol/L)的c9,t11-CLA培养BMECs 24 h,以确定c9,t11-CLA适宜的添加浓度;通过前期结果选用浓度为600μmol/L的H_(2)O_(2)和100μmol/L的c9,t11-CLA进行后续试验。试验设置3个组,分别为对照组、H_(2)O_(2)组、c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组,每组6个重复。对照组只用DMEM/F12基础培养基;H_(2)O_(2)组在基础培养基处理24 h后,再用600μmol/L H_(2)O_(2)培养细胞8 h;c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组在基础培养基中添加100μmol/L c9,t11-CLA处理24 h后,再用600μmol/L H_(2)O_(2)培养细胞8 h。试验对细胞内的丙二醛(MDA)活性、总抗氧化活性(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性等指标进行检测,并用RT-PCR法测定细胞的SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表达量。结果表明:与对照组相比,H_(2)O_(2)组的T-AOC活力(P<0.05)及SOD、CAT、GSH-Px活性(P<0.01)均下降,MDA含量上升(P<0.05),抗氧化酶SOD、CAT和GSHPx的mRNA表达量下降(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组BMECs的SOD、CAT和GSHPx活性(P<0.05)及其基因的mRNA表达量(P<0.05)均有提高,MDA含量降低(P<0.05)。由此可见,c9,t11-CLA可以提高H_(2)O_(2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力,为奶牛乳腺抗氧化剂的选择提供数据支撑。

牦牛乳腺上皮细胞-小鼠骨髓瘤细胞化学融合方法的研究

采用化学诱导的方法,选择不同分子量的PEG作为诱导剂,成功实现了牦牛乳腺上皮细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的融合,确定了PEG分子量为6000,浓度为50%,作用时间为90s的最佳融合条件.

热应激对体外培养小鼠乳腺上皮细胞cAMP、SOD和MDA水平的影响

为了研究在不同热应激强度处理下,小鼠乳腺上皮细胞环磷酸腺苷(c AMP)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化,试验将传至第3代的乳腺上皮细胞分为对照组(37℃)和热应激组,其中热应激组分为39℃组(0.5,1,1.5,2 h)和41℃组(0.5,1,1.5,2 h),同时提供5%CO2和饱和湿度的培养环境。结果表明:与37℃对照组相比,39℃培养1,1.5 h的小鼠乳腺上皮细胞c AMP水平显著升高(P<0.05);39℃培养2 h和41℃培养0.5,1,1.5,2 h的小鼠乳腺上皮细胞c AMP水平极显著升高(P<0.01)。与37℃对照组相比,39℃培养1.5 h的小鼠乳腺上皮细胞SOD活性显著高于对照组(P<0.05),39℃培养1 h、41℃培养0.5,1,1.5,2 h的小鼠乳腺上皮细胞SOD活性极显著高于对照组(P<0.01)。与37℃对照组相比,41℃培养1.5 h的小鼠乳腺上皮细胞MDA含量显著高于对照组(P<0.05),39℃培养0.5,1,1.5,2 h和41℃培养1 h的细胞内MDA含量极显著高于对照组(P<0.01)。说明随着热应激强度加强,小鼠乳腺上皮细胞的c AMP浓度上升;随着温度升高,MDA含量有下降趋势,SOD活性明显上升;在不同的热应激时间下,细胞的SOD活性呈下降趋势,MDA含量处于波动状态。

TNF-α诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死研究

[目的]本试验旨在探究肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导对小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死的影响。[方法]体外培养小鼠乳腺上皮细胞系(HC-11细胞)并分为4个处理组:对照(Ctrl)组、TNF-α(T)组、TNF-α+CHX(环己酰亚胺)(TC)组和TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK(Caspase家族抑制剂)(TCZ)组。向细胞中加入TNF-α(20、50、100 ng·mL^(-1))、CHX(4μmol·L^(-1))、Z-VAD-FMK(20μmol·L^(-1)),分别处理12 h和24 h,检测细胞活力和细胞凋亡及程序性坏死相关基因和蛋白的表达,利用透射电镜观察不同处理后细胞的超微结构变化。[结果]与对照组相比,100 ng·mL^(-1) TNF-α(T-100)处理12 h后细胞活力极显著降低(P<0.001),50 ng·mL^(-1) TNF-α(T-50)和100 ng·mL^(-1) TNF-α(T-100)处理24 h后细胞活力极显著降低(P<0.01),所有TC和TCZ处理12 h和24 h后细胞活力极显著降低(P<0.001);光学显微镜下观察发现T、TC和TCZ处理后细胞呈不同程度死亡;与对照组相比,T组和TC组Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均显著上升(P<0.05);T组和TC组Caspase-8 mRNA表达水平极显著上升(P<0.01),而TCZ组Caspase-8 mRNA水平极显著降低(P<0.001),TC组和TCZ组RIP3、MLKL mRNA表达水平极显著上升(P<0.001),但只有TCZ组程序性坏死标志蛋白RIP3、MLKL和p-MLKL表达量极显著上升(P<0.01),且p-MLKL/MLKL蛋白表达比值显著上升(P<0.05);与对照组相比,TCZ组细胞内出现空泡、线粒体肿胀、断裂等坏死细胞所具有的细胞超微结构变化;TC组和TCZ组PGAM5 mRNA表达水平极显著上升(P<0.001),TCZ组PGAM5蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),TC组和TCZ组Drp1 mRNA和蛋白表达水平均极显著上升(P<0.01)。[结论]TNF-α和TNF-α+CHX处理均可诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡,TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK处理可诱导小鼠乳腺上皮细胞发生程序性坏死。

β-谷甾醇对脂多糖诱导的乳腺上皮细胞氧化应激及乳脂合成的影响

本试验旨在探讨β-谷甾醇(BSS)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠乳腺上皮细胞(HC11细胞)氧化应激及乳脂合成的影响。试验以体外培养的HC11细胞为模型,分为5组:对照组(CON组,生长培养基处理)、乳腺炎症模型组(LPS组,1μg/mL LPS处理)以及炎症模型药物组(BSS+LPS组,分别用5、10、20μmol/L的BSS预处理1 h后加入1μg/mL LPS),每组设置5个重复。检测HC11细胞氧化应激指标及抗氧化相关基因、乳脂合成相关基因mRNA和蛋白表达的变化。结果表明:1)与CON组相比,LPS组的HC11细胞丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性显著升高(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化能力(T-AOC)显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞MDA、NO含量及iNOS活性显著降低(P<0.05),SOD、GPx、CAT活性和T-AOC显著升高(P<0.05)。2)与CON组相比,LPS组的HC11细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)mRNA和蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA和蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。3)与CON组相比,LPS组的HC11细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)mRNA和蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,5、10、20μmol/L BSS+LPS组的HC11细胞PPARγ和SREBP1 mRNA和蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),ACC、FAS和SCD mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。由此可见,BSS能够抑制LPS诱导的HC11细胞氧化损伤,并能促进氧化应激状态下HC11细胞乳脂的合成。

胞壁酰二肽对小鼠乳腺组织和乳腺细胞NOD2表达的影响

细菌感染是引起奶牛乳腺炎的主要原因,而胞壁酰二肽(MDP)几乎存在于所有细菌中,核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)受体是天然免疫中对病原微生物的病原体相关分子模式识别的一类感受器,在机体天然免疫应答中发挥重要作用。为了研究MDP对小鼠乳腺组织和乳腺细胞NOD2表达的影响,试验以小鼠为模型,采用不同浓度的MDP在体乳腺内灌注和对体外小鼠乳腺上皮细胞用不同浓度的MDP刺激,观察小鼠乳腺组织的病理组织学变化,乳腺组织及细胞中NOD2、下游的受体作用蛋白2(RIP2)表达的变化,以及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达变化。结果表明:从乳腺灌注不同浓度MDP后可引起急性乳腺炎,乳腺组织中炎性细胞增多;MDP刺激后乳腺组织及细胞中NOD2、RIP2、TNF-αmRNA表达水平明显升高,细胞IL-6 mRNA表达水平没有明显升高。说明NOD2介导信号途径促使炎性细胞因子的表达。