黄芩苷对GBS诱导小鼠乳腺炎症反应的干预作用及机制

为明确黄芩苷对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)诱导的小鼠乳腺组织炎症反应的干预作用及机制,本研究将分娩后7 d~10 d的40只健康BALB/c泌乳小鼠随机分为阴性对照组、感染组、高中低剂量黄芩苷治疗组(20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg)。感染组和治疗组以GBS感染BALB/c小鼠,治疗组于感染24 h后每6 h经乳导管灌注相应剂量的黄芩苷一次,连续4次,最后一次给药6 h后摘取乳腺组织,HE染色后观察乳腺组织病理变化;利用RT-q PCR和间接ELISA检测各组小鼠乳腺组织中炎症因子及NLRP3炎症小体通路相关因子m RNA的相对转录水平及分泌水平;利用免疫组化试验检测各组小鼠乳腺组织中NLRP3蛋白的定位及含量的变化。组织病变观察可见,GBS感染可导致小鼠乳腺上皮细胞坏死、脱落,乳腺腺泡腔固有结构消失;与感染组相比,各治疗组不同浓度的黄芩苷均可减轻小鼠乳腺组织病理损伤。RT-q PCR检测结果显示,感染组小鼠乳腺组织中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA的相对转录水平显著或极显著高于阴性对照组小鼠(P<0.05或P<0.01);与感染组相比,各治疗组显著或极显著(P<0.05或P<0.01)下调IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、Caspase-1、NLRP3和ASC基因m RNA的相对转录水平。ELISA检测结果显示,与感染组相比,各治疗组小鼠灌注不同浓度的黄芩苷可极显著(P<0.01)下调乳腺组织中IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白的分泌水平,且免疫组化试验结果显示各治疗组小鼠乳腺组织中NLRP3蛋白分布减少。综上所述,40 mg/kg黄芩苷降低小鼠乳腺炎症反应效果最好,可更有效下调NLRP3炎症小体通路相关基因m RNA相对转录水平,抑制NLRP3炎症小体活化,降低乳腺组织炎症因子m RNA相对转录和分泌水平,缓解GBS诱导的小鼠乳腺组织炎性损伤。本研究为应用黄芩苷治疗GBS感染导致的奶牛乳腺炎提供了参考依据。

金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性分析及其对小鼠乳腺炎的治疗效果评估

噬菌体作为一种天然裂解细菌的病毒,可用于细菌疾病治疗。旨在筛选出有效治疗小鼠乳腺炎的噬菌体,为奶牛乳腺炎防治提供参考。以实验室保存的金黄色葡萄球菌AA292菌株为宿主菌,分别从污水样、粪样中分离纯化出2株噬菌体,命名为φFJ04、φAH12。对2株噬菌体的生物学特性进行了分析,结果表明,φFJ04最佳感染复数为1,裂解量为149,温度耐受范围在40~50℃,pH耐受范围在3~10,宿主谱为63/90株;φAH12最佳感染复数为1,裂解量为448,耐受温度在40℃,pH耐受范围在4~12,宿主谱为28/90株。通过全基因组测序分析,发现φFJ04全长38 540 bp,(G+C)%=33.79%,含有48个ORF;φAH12全长264 664 bp,(G+C)%=24.7%,含有282个ORF。φFJ04、φAH12基因组内均不含整合元件、毒力基因和耐药基因,可用于体内治疗。对噬菌体杀菌效果进行评估,发现由φFJ04、φAH12组成的噬菌体鸡尾酒在6 h可以将10^(4) CFU/mL的金黄色葡萄球菌全部杀灭。施用10^(8) PFU/mL噬菌体鸡尾酒对10^(8) CFU/mLAA292所致的小鼠乳腺炎有明显改善作用,能使治疗组乳腺组织细菌载量下降2.8 log10CFU/g,杀菌效果约为99.84%。通过观察HE染色切片发现,治疗组乳腺腺泡结构较为完整,乳腺上皮细胞脱落显著减少,为奶牛乳腺炎防治提供了参考。

雪白睡莲花总黄酮提取工艺优化及其对金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的治疗效果

为探索响应面法结合超声辅助提取雪白睡莲花总黄酮的最优工艺条件。本试验以雪白睡莲花为材料,在单因素试验的基础上,采用响应面法考察乙醇浓度、超声功率、提取时间对雪白睡莲花总黄酮得率的影响;采用牛津杯法结合倍比稀释法测定抑菌圈、最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC),研究雪白睡莲花总黄酮对金黄色葡萄球菌在体外的抑制效果;同时,构建金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型,定期检测各试验组小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌的数量、TNF-α及IL-6的含量,观察小鼠乳腺组织病理学变化,研究雪白睡莲花总黄酮对金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的体内治疗效果。结果显示,雪白睡莲花总黄酮最佳提取工艺条件为:乙醇浓度81%,超声功率60%,提取时间20 min,料液比1∶30 kg/L,提取温度60℃。在此条件下,雪白睡莲花总黄酮得率达到12.00%,与预测值11.99%相近。与小鼠乳腺炎模型组对比,雪白睡莲花总黄酮组小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌的数量、TNF-α及IL-6的含量均显著降低(P<0.01),乳腺组织中的炎症细胞和红细胞明显减少。结果表明,采用响应面法对雪白睡莲花总黄酮提取条件进行优化合理可行,雪白睡莲花总黄酮具有较好的体内抑菌抗炎功效。

奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎小鼠模型的建立

目的利用从临床乳腺炎奶牛乳样中分离纯化的金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染小鼠乳腺,建立奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎小鼠模型。方法将产后8～10 d的ICR远交系母鼠随机分为3组,包括无菌生理盐水对照组,低剂量攻菌组(含金黄色葡萄球菌2×102CFU)和高剂量攻菌组(含金黄色葡萄球菌5×106CFU)。以小鼠第4对乳腺为攻菌部位,用非损伤方法经乳头管注入生理盐水或金黄色葡萄球菌。攻菌24h后采集乳汁进行白细胞计数;从眼球采血,进行血常规检测和流式细胞计数;之后处死母鼠,取乳腺组织进行匀浆细菌计数,并做乳腺组织切片。结果高剂量攻菌组不论是体温、组织学观察,还是乳汁白细胞计数、乳腺匀浆细菌计数、血常规指标和流式细胞计数,都和对照组有显著或极显著差异(P<0.05);而低剂量攻菌组与对照组相比,除血液CD4+/CD8+比值差异显著外(P<0.05),其余指标差异均不显著。结论金黄色葡萄球菌浓度为5×106CFU、攻菌时间24 h时,成功建立了远交系小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎模型,而2×102CFU细菌浓度则不适于远交系小鼠乳腺炎模型的建立。

蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎治疗效果的研究

目的研究蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎的治疗效果。方法本试验采用金黄色葡萄球菌诱导蝇蛆,从蝇蛆中提取抗菌肽并用于治疗金黄色葡萄球菌性乳腺炎。采用分娩后6～8 d的BALB/C雌鼠120只,随机分组:空白对照组、生理盐水治疗组、抗生素治疗组和抗菌肽治疗组,每组30只。空白对照组不做处理,另外3组用金黄色葡萄球菌感染小鼠建立小鼠乳腺炎模型,建模成功后,各试验组使用相对应的药物连续治疗7 d,并于第3、5、7天每组分别断颈处死10只小鼠,观察小鼠乳腺病理组织及HE染色切片,测定小鼠乳腺组织中TNF-α含量和金黄色葡萄球菌数量。结果经过金黄色葡萄球菌诱导产生的抗菌肽浓度显著高于未诱导组(P<0.05)、对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性、对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.5 mg/L,蝇蛆抗菌肽可显著抑制小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌的生长(P<0.05)、降低乳腺组织的损伤和极显著下调TNF-α的含量(P<0.01)。结论蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎治疗有一定治疗效果。

活性己糖相关化合物对硫酸头孢喹诺预防和治疗乳腺炎模型小鼠的增强作用

为了提高硫酸头孢喹诺对小鼠乳房炎模型的防治效果,试验通过小鼠乳腺炎模型研究活性己糖相关化合物(AHCC)对硫酸头孢喹诺杀菌活性的影响,制订了预防性试验和治疗性试验两种方案。预防试验即在建立小鼠乳腺炎模型前给小鼠灌服AHCC 7 d,模型建立后连续3 d肌肉注射硫酸头孢喹诺(5组);治疗试验即在建立小鼠乳腺炎模型后连续3 d同时灌服AHCC和肌肉注射硫酸头孢喹诺(5组)。设空白对照组(1组)、阴性对照组(2组)及只灌服AHCC和硫酸头孢喹诺的3组和4组。结果表明:预防试验和治疗试验中,与1组比较,3组和5组的CD4+T细胞和γ/δT细胞含量都能极显著增加(P<0.001),并且局部乳腺组织含菌量降低,乳腺组织结构恢复完整。对比两种方案发现,AHCC的预防效果远优于治疗效果。说明AHCC联合硫酸头孢喹诺对金黄色葡萄球菌引起的小鼠乳腺炎的预防具有非常好的增强作用。

牛源金黄色葡萄球菌α溶血素单链抗体对小鼠乳腺的保护作用

为探究治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,研究将前期获得的特异性针对金黄色葡萄球菌毒力因子α溶血素的单链抗体scFvZZ107,在小鼠感染金黄色葡萄球菌乳腺炎模型中验证其保护作用。结果显示,3种不同剂量(5、10、15μg)单链抗体处理组乳腺组织内细菌数量分别为25.42±1.3、3.33±0.53和4.8±0.78 lgcfu/mg,IL-1α的含量分别为49±7.91、31.37±2.26和57.34±4.48 pg/mL,IL-1β含量分别为40.91±7.39、47.81±4.78和39.2±2.28 pg/mL,IL-8的含量分别为48.64±1.86、41.65±3.07和45.74±1.56 pg/mL,与生理盐水处理组相比,单链抗体中、高剂量处理组乳腺内金黄色葡萄球菌检出量显著减少(P<0.05),且IL-1α、IL-1β与IL-8的含量均显著降低(P<0.05)。通过观察小鼠乳腺组织HE和TUNEL染色情况,与生理盐水处理组相比,scFv中、高剂量处理组乳腺组织更加完整,凋亡细胞的数量也更少,表明scFvZZ107对小鼠乳腺具有良好的保护作用。