PPARγ基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因RNA干扰的真核表达载体,转染小鼠3T3-L1前体脂肪细胞,并鉴定其干扰效果。方法选择设计2条针对小鼠PPARγ基因的干扰靶序列,构建真核表达载体PLKO.1-PPARγ-GFP-shRNA1/2,以PCR鉴定并进行序列分析。证实质粒构建成功后,转染小鼠3T3-L1前体脂肪细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(eGFP)的表达,计算转染效率;采用实时定量PCR法和Western印迹检测载体对PPARγ基因的表达干扰效果;采用油红染色观察PPARγ在脂肪细胞分化过程中对脂滴形成的作用。结果成功构建PPARγ干扰质粒PLKO.1-PPARγ-GFP-shRNA1/2,PCR和DNA测序证实序列与设计完全一致;荧光显微镜下观察到3T3-L1细胞绿色荧光蛋白的表达,证实重组质粒成功转入细胞,转染效率(92.67±1.53)%;实时荧光定量PCR和Western Blot印记试验均显示PLKO.1-PPARγ-GFP-shRNA1/2转染的3T3-L1细胞PPARγ基因分别被特异性抑制;靶点1干扰效率[(78.2±2.1)%]高于靶点2[(55.8±4.3)%],差异有统计学意义(P<0.05),靶点1初步鉴定为有效靶点。油红染色显示PLKO.1-PPARγ-GFP-shRNA1/2转染均可抑制3T3-L1脂肪细胞分化和脂滴聚集。结论成功构建了靶向干扰PPARγ基因的shRNA真核表达质粒PLKO.1-PPARγ-GFP-shRNA1/2,并筛选出有效抑制靶基因的表达质粒,初步验证PPARγ基因对脂肪细胞分化的作用,为进一步研究提供了有效的分子生物学工具。

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果。方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因的shRNA真核表达质粒PLKO.1-S100A16-GFP-shRNA1、2,经PCR鉴定和测序分析,确认质粒构建成功后,用脂质体LipofectamineTM 2000将重组质粒瞬时转染小鼠3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,Real-time RT-PCR法检测质粒对S100A16基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到3T3-L1细胞表达绿色荧光蛋白(GFP),证实重组质粒已转入细胞,转染效率达到90%;Real-time RT-PCR结果显示转入PLKO.1-S100A16-GFP-shRNA2的3T3-L1细胞中S100A16基因被特异抑制,基因表达抑制率达70%以上,与空白对照组、阴性序列对照组的差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:成功构建了靶向S100A16基因的shRNA真核表达质粒PLKO.1-S100A16-GFP-shRNA1和2,并筛选出有效抑制S100A16基因表达的质粒,为进一步研究S100A16基因功能奠定了基础。