MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹(Western blotting)检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶(ALP)染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物(miR-103-3p mimics)及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因m RNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制(P<0.05),Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。

镁离子联合矿化胶原干预小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期研究证实,镁基金属与矿化胶原联合应用在修复极限缺损时具有良好的支撑效果,可在一定程度上改善矿化胶原机械强度过差及在骨愈合期间过早塌陷的问题。然而,镁基金属在含氯化物溶液(包括人体体液或血浆)中降解较快,其中释放镁离子对成骨细胞增殖分化等的影响尚不清楚。目的:分析镁离子联合矿化胶原对小鼠前成骨细胞体外成骨分化能力的影响。方法:分别采用镁离子浓度为0,5,10,20 mmol/L的完全培养基制备矿化胶原浸提液,以4种矿化胶原浸提液培养小鼠前成骨细胞,分别设为矿化胶原组及5,10,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组,以完全培养基培养的小鼠前成骨细胞为空白对照组。观察细胞的形态、增殖、凋亡、细胞内微丝肌动蛋白与成骨诱导分化后的碱性磷酸酶活性及成骨基因Runx2的表达。结果与结论:①培养24 h,矿化胶原组、5,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞贴壁情况良好,与空白对照组无明显差异,细胞形态呈长梭形,表面有多个突触与邻近的细胞相联系;20 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞呈现明显的核浓缩;②培养1,3,5 d时,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞活力高于其余4组(P<0.05),矿化胶原组、5 mmol/L Mg2++矿化胶原组与空白对照组无差异(P>0.05),20 mmol/L Mg2++矿化胶原组低于空白对照组(P<0.05);③培养3 d后DAPI染色显示,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组可见明显细胞核解体的现象,其余4组未见明显细胞核解体;④培养24 h后鬼笔环肽染色显示,除空白对照组、20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组细胞结构完整伸展,肌动蛋白微丝清晰明显,尤以10mmol/LMg2++矿化胶原组最为明显;⑤成骨诱导分化7 d后,除20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组碱性磷酸酶活性与Runx2基因表达均高于空白对照组(P<0.05),且10 mmol/L Mg2++矿化胶原组高于5 mmol/L Mg2++矿化胶原组、矿化胶原组(P<0.05);⑥结果表明,镁离子与矿化胶原联合应用需要在适当的镁离子浓度范围(≤10 mmol/L)下进行。

聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散,使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法:分别制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)上,以单独培养的细胞为空白对照(D组),扫描电镜下观察材料表面的细胞黏附形态,通过CCK-8、碱性磷酸酶活性、酶联免疫吸附实验、RT-PCR与Western blot检测分析3种材料对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,MC3T3-E1细胞在A组复合材料表面黏附数量最多,生长状态良好,细胞拉伸明显,伪足伸出较多,细胞相互连接成网状结构;(2)CCK-8实验显示,与D组相比,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞的增殖(P<0.05),其中以A组复合材料促增殖效果最显著(P<0.05);(3)与D组相比,3种材料均可提升MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶活性(P<0.05),其中以A组提升最显著(P<0.05);(4)酶联免疫吸附实验显示,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素与I型胶原,其中以A组促进作用最显著(P<0.05);(5)RT-PCR检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的m RNA表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(6)Western blot检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的蛋白表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(7)结果表明,聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白与基因的表达,对其成骨分化起积极作用。

葛根素通过下调miR-23a促进小鼠前成骨细胞增殖和分化的研究

目的探讨葛根素是否通过下调miR-23a促进小鼠前成骨细胞增殖和分化。方法将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分为对照组、葛根素组、葛根素+miR-NC组和葛根素+miR-23a过表达组,RT-qPCR检测细胞中miR-23a的表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶活性检测葛根素对细胞活力的影响,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达。应用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验验证miR-23a和Runx2的靶向调控关系。结果与对照组相比,葛根素组MC3T3-E1细胞增殖活性增强,细胞中miR-23a表达降低,Runx2蛋白表达水平升高(P<0.05);与葛根素+miR-NC组相比,葛根素+miR-23a过表达组MC3T3-E1细胞增殖活性降低,细胞中Runx2蛋白表达降低(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-23a靶向负调控Runx2的表达。结论葛根素促进小鼠前成骨细胞增殖和分化,机制可能与下调miR-23a进一步调控Runx2表达有关。

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞增殖活性及细胞周期影响的实验研究

目的:观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)增殖活性及细胞周期变化的影响,探讨该方剂治疗牙周炎的作用机理。方法:MC3T3-E1细胞分别于5%、10%、15%、20%补肾活血固齿方含药血清,10%无药血清,10%胎牛血清中培养12、24、36、48、60、72 h,MTT法检测补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响。另外MC3T3-E1细胞分别于10%补肾活血固齿方含药血清、无药血清、胎牛血清中培养24、48、72 h,用流式细胞仪检测该方剂对MC3T3-E1细胞细胞周期的影响。结果:含药血清与胎牛血清、无药血清组相比,MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期差异无显著性(P>0.05)。结论:补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期无影响,其可能是通过促进该细胞向成骨细胞分化、促进牙槽骨的再生而发挥药物作用。

二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞增殖和分化的影响

目的 :探讨低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、成骨分化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:将MC3T3-E1细胞接种到培养板24h后,实验组培养基中分别加入50μM(50μM组)和200μM(200μM组)的DMOG,对照组加入完全培养液。分别于培养1、3、5d时采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,5、10d行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测成骨细胞分化,21d用茜素红染色检测MC3T3-E1细胞钙结节的形成并进行定量分析,采用ELISA法检测MC3T3-E1培养3d情况时上清液中的VEGF蛋白含量,并用实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞VEGF mRNA的相对表达量。结果:培养1d时对照组、50μM组和200μM组的MC3T3-E1的光密度(optical density,OD)值分别为0.041±0.009、0.074±0.019、0.086±0.044,3d时分别为0.123±0.027、0.148±0.020、0.224±0.061,5d时分别为0.297±0.044、0.325±0.084、0.354±0.038,1d、3d时50μM组和200μM组与同时间点对照组比较均有显著性差异(P<0.05),3d时50μM组与200μM组有显著性差异(P<0.05)。培养5d和10d时对照组ALP染色颜色较深,50μM组颜色中等,200μM组颜色较浅;5d时对照组ALP活性为1.943±0.072,50μM组为1.632±0.051,200μM组为1.319±0.065;10d时对照组ALP活性为3.734±0.067,50μM组为3.381±0.070,200μM组为2.831±0.086。三组间同时间点比较均有统计学差异(P<0.05),同组10d时与5d时比较均有统计学差异(P<0.05)。茜素红染色200μM组可见少量红色结节,50μM组可见中等量红色结节,对照组可见大量红色结节;对照组茜素红含量(μg/ml)为56.178±7.940,50μM组为41.922±2.438,200μM组为31.929±1.922,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。培养3d时对照组细胞培养上清液中VEGF蛋白含量(ng/孔)为9.063±0.603,50μM组为12.123±0.870,200μM组为15.540±0.581,三组间比较均有统计学差异(P<0.05);50μM组VEGF mRNA表达量为对照组的1.792±0.067,200μM组为对照组的3.963±0.092,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。结论 :低氧模拟剂DMOG可促进MC3T3-E1细胞增殖和VEGF表达,抑制其成骨分化。

3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸对成骨细胞前体增殖和成骨分化的作用

目的观察不同浓度的3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸(3,3',5-triiodo-L-thyronine,T3)对小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)细胞增殖及分化水平的作用.方法分别给予不同浓度T3干预细胞,培养1、2、3 d后采用CCK8法检测细胞增殖水平;在成骨分化诱导试剂干预7 d基础上,结合上述T3给药,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测各浓度组成骨细胞分化水平,通过实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测各浓度组的成骨细胞标记性基因及蛋白的表达差异.结果在分别干预1、2、3 d后,T3随着浓度增高,对细胞的增殖水平均呈明显上调;而且相同剂量的T3对于细胞增殖呈时间依赖性增强.此外,MC3T3-E1 Subclone 14细胞诱导7 d后,对比于0对照组,低浓度T3(1 nmol/L)对成骨细胞各分化参数均无明显作用,而10、100、1000 nmol/L的T3对细胞ALP染色,成骨细胞相关基因及蛋白均明显上调,其中以10和100 nmol/L组最为显著.结论T3对于MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖和成骨细胞分化均有显著的促进作用.

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P<0.05);DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。

淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究

目的:研究传统中药淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)对小鼠颅顶前成骨细胞(preosteoblasts in mice calvarium,MC3T3-E1)的细胞活性及成骨分化的影响。方法:筛选出ICA的最佳干预浓度,将MC3T3-E1细胞分为空白对照组及不同浓度的实验组,实验组以含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L的ICA完全培养液分别处理MC3T3-E1细胞。分别于培养2、4、6 d后用CCK8试剂盒检测MC3T3-E1细胞增殖能力;于培养3、6、9 d后用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测其ALP活性;根据检测结果,分别用完全培养液、成骨诱导液、含10-7 mol/L的ICA完全培养液处理MC3T3-E1细胞21 d后,再分别作茜素红染色。结果:与空白对照组相比,药物处理组明显抑制了MC3T3-E1细胞的增殖,但促进了MC3T3-E1细胞的ALP活性;而不同浓度的ICA培养的细胞对其钙结节的形成影响不明显。结论:在我们的实验条件下,ICA可能抑制了MC3T3-E1细胞的增殖,促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化。

培哚普利对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的研究不同浓度培哚普利对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响,从而探讨培哚普利对成骨细胞的作用。方法体外培养MC3T3-E1细胞,构建细胞实验模型;采用CCK-8法检测不同浓度(0、1×10^(-3)、1×10^(-4)、1×10^(-5)、1×10^(-6) mol·L^(-1))培哚普利干预下MC3T3-E1细胞的增殖变化;分别用不同浓度培哚普利干预MC3T3-E1细胞3、5及7 d,用碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测其活性。结果培养的MC3T3-E1细胞生长活跃,状态良好。细胞经培养48 h后,1×10^(-5) mol·L^(-1)培哚普利产生促细胞增殖作用(P<0.05),1×10^(-6) mol·L^(-1)培哚普利促细胞增殖作用明显(P<0.01);细胞经不同浓度培哚普利作用3、5及7 d后,与溶媒对照组相比,培哚普利各组细胞ALP活性之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论一定时间内,一定浓度的培哚普利对体外培养的MC3T3-E1细胞具有促增殖作用,但对其早期分化没有影响。

载rhPTH(1-34)纳米缓释纤维促成骨作用的体外研究

目的:制备载甲状旁腺相关肽(rhPTH(1-34))的电纺丝缓释纤维,研究其缓释效果及对成骨细胞增殖、分化的影响。方法:制备含rhPTH(1-34)电纺丝缓释纤维(PLLA/rhPTH(1-34)),扫描电镜(SEM)观察其形貌。紫外分光光度法测定释放速率。噻唑蓝法(MTT)测定PLLA/rhPTH(1-34)对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的增值活性,碱性磷酸酶(ALP)测定其分化。结果:含模型药物的电纺丝缓释纤维体外有效释放21d,PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维促进细胞的增殖作用明显(P<0.05),并能显著促进细胞的分化(P<0.05)。结论:PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维可以有效缓释药物,并能促进MC3T3-E1DE增殖、分化。

载槲皮素明胶微球对MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的研究负载槲皮素的明胶三维多孔(G-quercetin)微球作为骨组织材料的可行性。方法利用乳化法制备负载槲皮素的多孔明胶微球,扫描电镜观察微球形态,通过免疫荧光染色、活死细胞染色和CCK-8、碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色检测微球的细胞毒性及其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)黏附、增殖及分化的影响,RT-PCR检测成骨相关基因Runx-2、ALP、OPN、OCN表达。结果扫描电镜结果显示制备的载槲皮素明胶三维微孔材料具有多孔结构。细胞黏附检测显示细胞能够在微球表面铺展良好。与对照组相比,活死细胞染色、CCK-8结果显示该微球无明显细胞毒性(P>0.05);与G-quercetin微球共培养的MC3T3-E1 ALP表达和体外矿化增加;PCR结果显示Runx-2、ALP、OCN、OPN表达明显增高(P<0.05)。结论载槲皮素明胶微球具有良好的生物相容性,能够促进MC3T3-E1体外成骨分化,有望作为新型骨组织工程生物材料应用于临床。

基于虚拟筛选的丹参促成骨化合物筛选及活性验证

目的:借助虚拟筛选技术对丹参促成骨化合物进行筛选并通过体外实验对其活性进行验证。方法:TCMSP数据库查询丹参的活性成分;通过Autodock vina进行分子对接,CCK-8实验考察对细胞的增殖作用,碱性磷酸酶(ALP)活性实验、DAPI-鬼笔环肽双染以及茜素红染色观察促成骨作用。结果:根据分子对接及文献检索最终筛选得到丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA和隐丹参酮4种活性成分。CCK-8实验结果显示,丹酚酸B能够促进MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的增殖。ALP活性实验发现,丹参素和丹酚酸B能显著增加MC3T3-E1细胞的ALP活性。DAPI-鬼笔环肽双染及茜素红染色实验进一步证明了丹酚酸B对MC3T3-E1细胞具有一定的促成骨作用。结论:通过分子对接技术筛选出来的丹酚酸B在经过活性验证后,证明其具有一定的促成骨作用。

聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

背景:细胞球三维培养模型在组织工程领域应用前景广泛,但使用商品化超低吸附培养板进行细胞球培养的实验成本较高,因此需探寻一种细胞球成形的替代策略,推动细胞球在相关研究领域的应用。目的:采用琼脂糖和聚丙烯酸模具,并利用层层自组装技术构建细胞球三维培养模型,部分模拟细胞体内生存的微环境。方法:体外培养小鼠前体成骨细胞,依次使用明胶与海藻酸钠对小鼠前体成骨细胞进行层层自组装处理(层层自组装-小鼠前体成骨细胞),同时分别制备明胶包裹与海藻酸钠包裹的小鼠前体成骨细胞。分别制备琼脂糖凝胶涂层培养板与琼脂糖凝胶微孔板,观察上述不同处理的细胞在两种培养板中的成球效果,采用Live/Dead染色法检测细胞球的活性,采用碱性磷酸酶染色法、RT-PCR实验检测细胞球的成骨能力。结果与结论:(1)光学显微镜下可见,在琼脂糖凝胶涂层孔板中,未经处理与经3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞均未成球;在琼脂糖凝胶微孔板中,未经处理与层层自组装处理的小鼠前体成骨细胞形成了理想的细胞球,其中层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的直径大于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P <0.05);(2)Live/Dead染色显示,层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内的细胞活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P <0.05);(3)层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的碱性磷酸酶活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P <0.05),Ⅰ型胶原和Osterix基因表达高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P <0.05),两组Runx2基因表达比较差异无显著性意义(P> 0.05);(4)结果表明,采用琼脂糖凝胶结合层层自组装技术成功建立了细胞球三维培养模型,此方法便捷、经济、高效且细胞活性良好,保留了细胞成骨分化能力,在骨组织工程和再生医学领域具有潜在应用价值。

3D打印聚醚醚酮/羟基磷灰石复合物的生物相容性评价

背景:聚醚醚酮材料具有稳定的物理、化学、力学性质,辐射透明性及与人体骨骼相似的弹性模量等优点,但存在着生物惰性的问题,限制了其在临床中的应用。目的:评价熔融沉积型3D打印技术制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料的生物相容性。方法:以聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石(羟基磷灰石质量分数为10%)丝材为原料,应用熔融沉积型3D打印技术分别制备聚醚醚酮材料(对照组)、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料(实验组)。将第3代小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分别与两组材料浸提液共培养,以单独培养的细胞为阳性对照,通过Live/Dead荧光染色和CCK-8实验检测细胞的存活与增殖情况;将第3代小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分别接种于两种材料表面,利用扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在材料表面的黏附生长、增殖情况。结果与结论:①Live/Dead荧光染色显示,MC3T3-E1细胞在两组材料浸提液中生长良好,细胞活力良好,细胞存活率在90%以上,说明两种材料均无明显细胞毒性,随着培养时间的延长,细胞增殖良好;②CCK-8实验结果显示,两种材料无明显的细胞毒性,其中实验组培养3,5,7 d的细胞增殖吸光度值大于阳性对照组、对照组(P<0.05);③扫描电镜下可见,接种第1天时,MC3T3-E1细胞在两组材料表面黏附生长,细胞铺展良好,其中以实验组细胞分泌的基质较多;第3天时,黏附于两组材料表面的细胞增多,同时分泌更多的基质,其中以实验组材料表面黏附细胞数量及基质分泌更多;第7天时,两组材料表面出现细胞重叠生长现象,实验组材料上细胞铺展生长、分泌基质的效率更高;④结果表明,3D打印制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料具有良好的生物相容性。

黄瓜籽总黄酮对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

目的探讨黄瓜籽总黄酮提取物(cucumber seed flavonoids,CSF)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)增殖、分化和矿化的影响,以及对富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa B,RANK)信号通路的作用。方法通过噻唑蓝(MTT)实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSF对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平;Western blot检测OPG/RANKL的蛋白表达量。结果CSF高、中剂量组能够明显提高细胞增殖率(P<0.05),分别为阳性对照组的1.92和1.77倍;CSF高、中剂量组ALP活性为(2.756±0.073)和(1.961±0.107)U/mL,明显高于阳性对照组(0.453±0.029)U/mL(P<0.05);CSF高、中剂量组钙化结节面积为(34.899±0.811)和(22.112±0.914)mm 2/10个视野,与阳性对照组(16.577±0.649)mm 2/10个视野相比明显增加(P<0.05);与空白组相比,CSF高、中剂量组在不同时间点均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA表达量,并促进OPG/RANKL蛋白表达水平(P<0.05)。结论黄瓜籽总黄酮类成分能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。

杜仲中松脂素二葡萄糖苷和松脂素对成骨细胞中OPG和RANKL表达的影响

目的：观察杜仲中松脂素二葡萄糖苷及其苷元松脂素对体外培养的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的影响。方法：采用质量浓度为1×10^-7-1×10^3μg·L^-1的松脂素二葡萄糖苷与松脂素体外干预MC3T3-E1成骨细胞48,72 h,采用噻唑蓝法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞分化情况,酶联免疫吸附测定法（ELISA）和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测细胞骨保护素（OPG）与核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）蛋白表达的水平。结果：与空白组相比,培养48 h,1×10^-4-100μg·L^-1松脂素二葡萄糖苷及1×10^-4-1μg·L^-1松脂素均能促进成骨细胞增殖（P〈0.05,P〈0.01）;培养72 h,1×10^-3-100μg·L^-1松脂素二葡萄糖苷及0.1μg·L^-1松脂素能促进成骨细胞增殖（P〈0.05,P〈0.01）。与空白组相比,培养48 h时,质量浓度为1×10^-4-1×10^3μg·L^-1的松脂素二葡萄糖苷、松脂素均能够显著促进成骨细胞ALP分泌（P〈0.01）;培养72 h时,质量浓度为0.1-1×10^3μg·L^-1的松脂素二葡萄糖苷和1×10^-4-1×10^3μg·L^-1松脂素均能显著促进成骨细胞ALP分泌（P〈0.05,P〈0.01）。与空白组相比,培养48 h,1×10^-5-10μg·L^-1的松脂素二葡萄糖苷和松脂素均能促进细OPG蛋白分泌（P〈0.05,P〈0.01）;只有松脂素在1×10^-5,1×10^-3μg·L^-1时能明显抑制RANKL蛋白的分泌（P〈0.01）,在1×10^-5-0.1μg·L^-1时提高OPG/RANKL（P〈0.01）。结论：松脂素二葡萄糖苷与松脂素均能通过促进成骨细胞的增殖和分化达到抗骨质疏松作用,但其作用机制不同,松脂素二葡萄糖苷主要通过促进OPG分泌来发挥,而松脂素则既能通过促进OPG分泌又能通过抑制RANKL表达来发挥作用。

明胶改性聚醚醚酮微载体的制备、表征及性能

微载体因其具有较高的表面积/体积比等优点可以大大提高哺乳动物细胞培养效率,被广泛应用于生物制药和组织工程等领域。但微载体多为一次性使用,不耐高温,且主要依赖进口,价格昂贵,因而限制了其国内的应用和推广。聚醚醚酮(PEEK)材料具有良好的生物相容性、化学稳定性及耐高温等特性,是一种优异的微载体材料,但存在熔点高,加工方法单一和生物惰性等缺陷。本文以浓硫酸为溶剂,乙醇溶液为萃取剂,采用气流辅助滴注/相分离法,将PEEK制备成448μm左右,尺寸均匀的微球;经氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理,获得表面氨基化修饰的PEEK微球(PEEK-N);进一步,以N,N′-羰基二咪唑(CDI)为活性中间体,将明胶分子接枝到PEEK-N微球表面,获得表面明胶修饰的PEEK微载体(PEEK-G)。对材料的物理化学性质、表面接枝量进行表征;并通过体外细胞实验评估其细胞毒性、细胞粘附效率和细胞增殖能力。结果显示,通过该方法制备成功了3种不同明胶接枝含量的PEEK细胞微载体(PEEK-G1,PEEK-G2,PEEK-G3),其中明胶含量较高的PEEK-G3毒性最低,细胞粘附和增殖效果最理想。