依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。

CFSE荧光负染法检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞摄取超顺磁性氧化铁纳米粒子

目的:探讨CFSE荧光负染法用于检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞吞噬超顺磁性氧化铁纳米粒子(super paramaganetic iron oxide nanoparticles,SPIO)的可行性及其荧光特征。方法:体外对RAW264.7细胞进行SPIO的标记,然后分别采用普鲁士蓝染色方法和CFSE荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取情况;用台盼蓝染色法检测CFSE荧光负染细胞的活力;应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取。结果:普鲁士蓝将RAW264.7细胞内吞噬的SPIO标记为醒目的蓝色,核固红将细胞核标记为红色,在荧光图像上表现为荧光负染区,呈筛孔状。CFSE荧光负染法与普鲁士蓝染色法的检测结果具有很好的对应性。RAW264.7细胞经过SPIO和CFSE双重标记后,对细胞活力的影响较小,死细胞比例较低。结论:CFSE荧光负染法可用于RAW264.7活细胞吞噬SPIO的检测,同普鲁士蓝染色法具有很好的对应性,两者的检测结果可相互印证。

连接蛋白43在吡啡尼酮促进小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化中的作用

目的探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是否能够调节吡啡尼酮(pirfenidone,PFD)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化。方法将体外培养的对数生长期小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组(Control组)、PFD组、PFD+Cx43特异性阻断剂Gap19组(PFD+Gap19组)、吡啡尼酮+阴性慢病毒对照组(PFD+NC组)、吡啡尼酮+Cx43过表达慢病毒组(PFD+OE组)。采用慢病毒转染技术,加入含有过表达慢病毒的培养基,使Cx43在巨噬细胞中过表达。采用Western blot技术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M2型极化标记物CD206、Arg-1的蛋白表达水平,采用倒置荧光显微镜观察小鼠RAW264.7巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg-1)和CD206的蛋白表达和定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测Cx43,Arg-1和CD206的RNA表达水平。结果PFD组中的Cx43蛋白表达与Control组相比降低;PFD组中的M2型极化标志物CD206和Arg-1与Control组相比大幅升高;与PFD组相比,在PFD+Gap19组中Arg-1和CD206的表达均显著升高;与PFD组相比,在PFD+NC组中Arg-1和CD206的表达无明显改变。与PFD+NC组相比,PFD+OE组中Arg-1和CD206的表达均显著降低。结论PFD可以通过下调Cx43促进小鼠RAW264.7巨噬细胞向M2型极化。通过Gap19和过表达慢病毒调节Cx43的表达,也可调节巨噬细胞M2型极化。

鱼腥草素钠对脂多糖诱导单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的探讨鱼腥草素钠(SH)对脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用及其机制。方法实验分为空白对照组(等体积培养基),模型组(等体积培养基),SH低、中、高剂量组(1.25,5,10μmol/L),以含不同浓度SH的常规培养基培养细胞2 h,后4组细胞加入LPS继续培养24 h。收集细胞上清液,测定一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及前列腺素E_(2)(PGE_(2))的水平;提取细胞总蛋白,采用Westernblot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)蛋白及核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白(NF-κB-P-P65蛋白和P-IκB-α蛋白)的表达水平。结果与模型组比较,SH中、高剂量组细胞NO水平显著降低,SH低、中、高剂量组细胞TNF-α,IL-6,PGE_(2)水平和COX-2,NF-κB-P-P65,P-IκB-α蛋白表达水平均显著降低,SH中、高剂量组细胞iNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论SH能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的分泌,其作用机制与抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表达及NF-κB通路相关蛋白的磷酸化有关。

培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的影响

目的 探讨培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响。方法 实验分为3组:高糖DMEM培养基组(DMEM组);高糖DMEM/α-MEM培养基组(DMEM/α-MEM组);α-MEM培养基组(α-MEM组)。按常规方法采用上述3种培养基进行破骨细胞培养,培养5 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色观察各组破骨细胞的形成情况,并采用实时荧光定量PCR方法观察破骨细胞分化相关标志物NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA的表达;培养11 d后采用甲苯胺蓝染色进行骨陷窝面积分析,观察破骨细胞骨吸收功能情况。结果 3组均可以观察到典型的TRAP^(+)破骨细胞。与DMEM组相比,DMEM/α-MEM组、α-MEM组TRAP^(+)破骨细胞数量明显增加(P<0.01),但各组形态略有不同。在骨吸收功能上,与DMEM组和DMEM/α-MEM组相比,α-MEM组骨陷窝面积明显增加(P<0.01)。在破骨细胞分化相关调控因子表达上,与DMEM组相比,α-MEM组NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA表达显著增加(P<0.01,P<0.05);DMEM/α-MEM组NFATc-1 mRNA表达显著增加(P<0.01),c-Fos和TRAF-6 mRNA表达有增加的趋势,但差异无统计学意义;α-MEM组与DMEM/α-MEM组比较差异无统计学意义。结论 高糖DMEM培养基、高糖DMEM/α-MEM培养基、α-MEM培养基均可用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的实验;从破骨细胞数量、状态及功能来看,α-MEM培养基更适合做为破骨细胞分化培养基。

木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶对小鼠巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用研究

目的:研究木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶的抗炎作用及机制。方法:以正常小鼠巨噬细胞RAW264.7为对照,以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为炎症模型,采用MTT法检测不同浓度(10、20、40、80μmol/L)的木犀草素、4,4′-联吡啶和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶作用细胞2 h后的细胞活性;荧光定量聚合酶链式反应法测定40μmol/L浓度时细胞中诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达,酶联免疫吸附法测定40μmol/L浓度时细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)蛋白表达,Western blot法测定40μmol/L浓度时细胞中核转录因子p65(NF-κB p65)蛋白表达。结果:与正常细胞比较,LPS诱导后RAW264.7细胞活性明显降低(P<0.01),i NOS和COX-2 m RNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。木犀草素和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶均能增强LPS诱导后RAW264.7细胞活性(P<0.05或P<0.01),且呈浓度依赖性;4,4′-联吡啶对LPS诱导后RAW264.7细胞活性无明显影响;40μmol/L浓度下,木犀草素和木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶可使LPS诱导后细胞中i NOS和COX-2 m RNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),其中木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶降低效果强于木犀草素(P<0.05或P<0.01)。结论:木犀草素·4,4′-联吡啶药物共晶可能通过下调NF-κB信号来抑制炎症相关因子产生,其抗炎作用优于木犀草素。

乌头酸脱羧酶1对BCG诱导巨噬细胞炎症反应的调控作用研究

旨在探究乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase 1,ACOD1)对减毒牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的调控作用。基于小干扰RNA技术构建ACOD1敲减模型,采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等技术检测BCG感染巨噬细胞RAW264.7后细胞内ACOD1、细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、COX2、iNOS以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白的表达变化。结果显示,BCG感染巨噬细胞RAW264.7后以时间和浓度依赖性方式显著上调ACOD1及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2、iNOS的表达,下调抑炎细胞因子IL-4、TGF-β的表达(P<0.01);si-ACOD1结合BCG感染会显著下调促炎细胞因子表达(P<0.01),同时也会下调TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65的表达。综上,ACOD1可能通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与调控BCG引起的炎症反应。

PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路在浒苔多糖粗提物调节小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能中的作用

目的:验证浒苔多糖粗提物上调小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能,并初步探讨其是否通过PI3K/PTEN/Akt/m TOR通路实现。方法:以不同浓度浒苔多糖粗提物干预RAW264.7细胞,干预不同时间后四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法测定巨噬细胞RAW264.7增殖率;ELISA法测定白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;实时荧光定量PCR检测m TORm RNA的表达水平;以100nmol/L雷帕霉素、500μg/ml浒苔多糖粗提物、500μg/m L浒苔多糖粗提物+100nmol/L雷帕霉素干预RAW264.7细胞,测定细胞因子IL-6、TNF-α分泌水平。结果:500μg/m L浒苔多糖粗提物干预12h,可获得最佳增殖率53.47%;RAW264.7细胞分泌IL-6的水平随着浒苔多糖粗提物浓度的增大而增加,且在24h达到分泌高峰,TNF-α分泌水平随着时间延长而增加(F=311.63,P<0.001),同时随着干预浓度的提高而增加(F=51.80,P<0.001);浒苔多糖粗提物干预12、24h后,m TOR表达水平增高(F=4.256,P=0.029;F=20.606,P<0.001);较之500μg/m L浒苔多糖粗提物组,500μg/m L浒苔粗提物+100nmol/L雷帕霉素组IL-6水平下降44.58%,TNF-α水平下降65.96%(P均<0.001)。结论:浒苔多糖粗提物促进巨噬细胞RAW264.7增殖,调节其细胞因子释放,可能与PI3K/PTEN/Akt/m TOR通路有关。

小鼠单核巨噬白血病细胞培养条件优化

目的探讨小鼠单核巨噬白血病细胞的细胞培养方法。方法采用胰酶消化和细胞刮棒的方法获得细胞最适的传代方法,比较培养基酸碱度、培养耗材等确定最佳培养条件。结果采用细胞刮棒方法,沿着细胞培养瓶一端顺势往另一端轻柔刮取细胞比胰酶消化法获得的细胞传代,对细胞的损伤更小,细胞状态更好,在所有细胞培养条件中,培养耗材的高压灭菌和培养基的酸碱度对细胞的影响最大,在培养过程中需要采取180℃高压灭菌和调节酸碱度来获得细胞的最佳状态。结论采用DMEM高唐培养基+10%FBS,细胞刮棒沿着一个方向轻轻刮取细胞,传代的比例最佳为1:4,采用过滤的HEPES每次实验时调节培养基酸碱度,是细胞的最佳培养条件。

重楼提取液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响

目的:观察重楼提取液对小鼠巨噬细胞RAW 264.7增殖的影响。方法:采用不同浓度(0μL/m L、1μL/m L、10μL/m L、50μL/m L、100μL/m L)的重楼提取液,作用于体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7,使用倒置显微镜观察细胞形态的变化;通过四唑盐比色法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖情况。结果:与阴性对照组相比,作用24 h后,50μL/m L、100μL/m L重楼提取液均能抑制RAW264.7细胞的增殖;作用48 h后,5μL/m L、10μL/m L、50μL/m L、100μL/m L均能抑制RAW264.7细胞的增殖,并且具有时间及浓度依赖性,其抑制效果在100μL/m L作用48 h时最好。结论:高浓度重楼提取液抑制细胞增殖,细胞接触变松,密度降低,贴壁能力减弱,可见较长伪足,生长状态差。

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松(DEX)诱导的RAW264.7细胞系凋亡(P<0.01)。1μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用(P<0.05);10μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有显著的促进作用(P<0.05)。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有极显著的促进作用(P<0.01),但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。

冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节的影响

为进一步开发冠突散囊菌的药理活性,该研究将冠突散囊菌与木霉共同发酵,通过不同体积分数的乙醇对混合发酵液化学活性部位进行追踪,并结合液质联用(LC-MS)技术对活性部位化合物组成进行分析,通过四氮甲基唑蓝(MTT)比色法、中性红吞噬实验及酶联免疫吸附测定方法分别研究冠突散囊菌与木霉混合发酵液活性部位对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌细胞因子的能力的影响。结果表明,冠突散囊菌与木霉混合发酵液体积分数70%乙醇提取部位有较好的免疫活性,该部位含有大黄素、芥子碱等生物活性成分。与阳性对照组脂多糖相比,500μg/mL冠突散囊菌与木霉混合发酵液的体积分数70%乙醇提物能够使小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率提高12%,增强小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力,并能促进NO及细胞因子IL-6、TNF-α的分泌。

脂肪分化相关蛋白2对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞自噬的调控作用

本研究旨在探讨脂肪分化相关蛋白2(perilipin 2,PLIN2)在卡介苗(bacillus calmette-guérin,BCG)感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7中对自噬的调控作用。利用小干扰RNA敲减小鼠巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达,结合BCG感染,通过免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光等技术,检测胞内PLIN2、自噬、内质网应激及脂肪酸代谢相关因子指标的表达变化。结果显示:BCG感染显著上调巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达(P<0.05),极显著上调自噬相关蛋白ATG5(P<0.01)、ATG12(P<0.001)及LC3(P<0.001)的表达,并伴随着细胞内中性脂质的蓄积。敲减PLIN2能使BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中自噬相关蛋白ATG5(P<0.05)和ATG12(P<0.05)显著下调以及LC3(P<0.001)极显著下调,细胞自噬率极显著降低(P<0.001),并极显著降低细胞内中性脂质的含量(P<0.001)。同时,敲减PLIN2显著下调CHOP(P<0.05),并极显著下调ATF4(P<0.001)内质网应激相关蛋白表达,细胞内Ca^(2+)浓度极显著降低(P<0.001)。此外,利用内质网应激激动剂Tunicamycin持续激活内质网应激通路后,无论是否敲减PLIN2,BCG感染的巨噬细胞内自噬相关蛋白表达均无显著差异(P>0.05)。BCG感染巨噬细胞上调了PLIN2的表达,而PLIN2通过上调细胞内脂肪酸含量,进而级联激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP内质网应激信号通路,诱导细胞自噬发生。

Siglec—E在脓毒症小鼠RAW264．7单核巨噬细胞的表达研究

目的研究Siglec—E在脓毒症小鼠RAW264．7单核巨噬细胞的表达。方法培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264．7，取对数生长期细胞，分别为对照组（Con组）、实验组（LPS组）在不同的时间点提取总的RNA和总蛋白，用RT—PCR法测细胞裂解液中Siglec—EmRNA表达；用Western blot测胞质Siglec—E蛋白含量。结果不同浓度的脂多糖（LPS）刺激后6～12h培养细胞Siglec—EmRNA和蛋白表达相对于Con组增高，24h表达量显著增高，而24～48h含量逐渐减少，各不同时间点的差异有统计学意义（P〈0．01）。结论Siglec—E在脓毒症炎症时表达量增加且呈现一定的时间和剂量依赖。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

橙皮苷通过下调HMGB1抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞MCP-1表达的实验研究

目的探讨橙皮苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用及相关的分子机制。方法将小鼠巨噬细胞系(RAW264.7巨噬细胞)分为对照组(Control组)、LPS组和LPS+橙皮苷组(LPS+HPD组)3组,在干预24小时后使用qPCR法和western blotting法对RAW264.7巨噬细胞MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果与Control组比较,在LPS干预24小时后RAW264.7巨噬细胞MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05);但LPS组较LPS+橙皮苷组MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达增加更加显著,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本实验结果表明,在LPS诱导的炎症状态下,橙皮苷可能可以通过抑制HMGB1的表达下调RAW264.7巨噬细胞MCP-1的合成和释放。

蔓荆子黄素对小鼠单核巨噬细胞增殖和凋亡的影响

目的通过蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞活性及RAW264.7细胞增殖和凋亡作用的研究,探讨蔓荆子黄素对单核巨噬细胞的影响。方法分别用含有不同浓度蔓荆子黄素作用于小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,于24、48及72 h后采用CCK-8检测细胞活性。使用AO/EB染色观察RAW264.7细胞凋亡变化;应用流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡率。通过荧光探针DCFH-DA检测RAW264.7细胞活性氧水平,使用JC-1染色标记线粒体膜电位的变化。结果 CCK-8法检测结果显示,蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞的细胞活性及RAW264.7细胞的增殖都有抑制作用,呈剂量与时间依赖关系,尤其对具有增殖能力的RAW264.7细胞活性抑制作用更强。AO/EB染色结果显示,RAW264.7细胞经浓度为5及10μmol/L的蔓荆子黄素处理后,细胞表现为凋亡形态;流式细胞仪检测结果显示,蔓荆子黄素诱导RAW264.7细胞Sub-G1期代表凋亡细胞的百分比增加(P<0.05)。蔓荆子黄素作用于RAW264.7细胞后,细胞内活性氧水平提高;JC-1染色结果显示,蔓荆子黄素能使RAW264.7细胞的线粒体膜电位下降。结论蔓荆子黄素能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7活性,尤其对具有增殖能力的RAW264.7细胞活性抑制作用更强,可以促进其凋亡,其作用机制与增加细胞内活性氧水平和降低线粒体膜电位有关。

RANKL诱导小鼠单核细胞RAW264．7分化成成熟破骨细胞

目的观察小鼠的单核／巨噬细胞RAW264．7的一般生物学特征及在RANKL诱导下形成成熟破骨细胞的特征。方法 RANKL诱导RAW264．7细胞6d后,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 染色法观察TRAP阳性多核细胞,吖啶橙染色激光共聚焦显微镜(LCSM)观察多核细胞形态;诱导RAW264．7细胞9d后,RT-PCR检测RAW264．7细胞的破骨细胞表型和功能基因表达及其 RANKL诱导后变化;诱导RAW264．7细胞12d后,钙磷覆盖的破骨细胞活性分析板观察破骨细胞的骨吸收功能。结果 RAW264．7细胞TRAP染色阴性,单核或2个核,能表达破骨细胞表型和功能基因,无骨吸收功能。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成TRAP阳性成熟的多核破骨细胞, 上调CathepsinK、CAⅡ、integrinβ3等基因。mRNA的表达。结论 RAW264．7具有破骨细胞特征性基因表达谱,是一种较好的破骨前体细胞模型。RANKL可诱导RAW264．7细胞形成成熟破骨细胞。