TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

模拟失重对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学功能的影响

目的通过2D回转器回转细胞模拟失重生物学效应,探讨模拟失重对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)多种生物学功能的影响特点,为深化空间失重免疫抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。方法将RAW264.7细胞分为对照组(NG组)、模拟失重组(SMG组),利用2D回转器模拟失重72 h后,采用CCK-8法和EdU法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞的增殖能力变化;细胞划痕实验和Transwell小室法检测巨噬细胞迁移功能的变化;探针DCFH-DA标记,倒置荧光显微镜观察和拍照检测巨噬细胞分泌活性氧(ROS)的变化。结果RAW264.7巨噬细胞模拟失重72 h后增殖受到抑制,CCK-8实验结果显示,NG组的细胞增殖速率显著高于SMG组(P<0.05);EdU染色结果显示,SMG组EdU掺入RAW264.7细胞核的量较NG组减少(P<0.01)。细胞划痕、Transwell实验检测表明72 h模拟失重对巨噬细胞的迁移能力有明显影响,与NG组相比,模拟失重后RAW264.7细胞迁移能力增强(P<0.05);探针DCFH-DA标记检测提示模拟失重对巨噬细胞分泌ROS有明显抑制作用(P<0.01)。结论回转模拟失重对RAW264.7细胞的生物学功能具有影响,表现为RAW264.7迁移运动能力增强,细胞增殖与ROS分泌能力受到抑制。

依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

文冠果叶黄酮对巨噬细胞RAW264.7细胞因子及TLR2受体的影响

通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法分析文冠果叶黄酮(XLF)对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响,酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子含量;通过XLF处理Toll样受体2(TLR2)抗体作用的巨噬细胞,研究TLR2受体对该细胞因子的介导作用。结果表明:当XLF质量浓度为320μg/mL时,巨噬细胞RAW 264.7分泌的NO、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)细胞因子最多,且与空白对照差异极显著,但都小于脂多糖(LPS);且与未加入TLR2抗体相比,加入了TLR2抗体的巨噬细胞减少了各细胞因子的分泌,且差异均极显著。XLF可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖及细胞因子的分泌,并且可能通过TLR2受体介导。

茶树菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响

为了揭示茶树菇多糖(AAP)在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响,本试验以RAW264.7为研究对象,将其分为空白对照(CON)组、AAP低剂量(AAPL)组、AAP中剂量(AAPM)组、AAP高剂量(AAPH)组和脂多糖(LPS)组,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测AAP对巨噬细胞RAW264.7的安全浓度;流式细胞仪检测巨噬细胞RAW264.7表面协同刺激分子抗原分化簇80(CD80)和86(CD86)的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的浓度。结果显示,AAP浓度低于250μg/mL,不会对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生毒性作用;与CON组相比,AAPM组和AAPH组RAW264.7细胞的表面分子CD80及所有AAP组RAW264.7细胞的表面分子CD86均极显著升高(P<0.01或P<0.001);AAPH组IL-1β及AAPM组和AAPH组IL-6、TNF-α和NO表达水平均显著增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结果表明,AAP能提高小鼠巨噬细胞RAW264.7表面分子CD80和CD86表达水平及细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NO的分泌能力。

连接蛋白43在吡啡尼酮促进小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化中的作用

目的探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是否能够调节吡啡尼酮(pirfenidone,PFD)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化。方法将体外培养的对数生长期小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组(Control组)、PFD组、PFD+Cx43特异性阻断剂Gap19组(PFD+Gap19组)、吡啡尼酮+阴性慢病毒对照组(PFD+NC组)、吡啡尼酮+Cx43过表达慢病毒组(PFD+OE组)。采用慢病毒转染技术,加入含有过表达慢病毒的培养基,使Cx43在巨噬细胞中过表达。采用Western blot技术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M2型极化标记物CD206、Arg-1的蛋白表达水平,采用倒置荧光显微镜观察小鼠RAW264.7巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg-1)和CD206的蛋白表达和定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测Cx43,Arg-1和CD206的RNA表达水平。结果PFD组中的Cx43蛋白表达与Control组相比降低;PFD组中的M2型极化标志物CD206和Arg-1与Control组相比大幅升高;与PFD组相比,在PFD+Gap19组中Arg-1和CD206的表达均显著升高;与PFD组相比,在PFD+NC组中Arg-1和CD206的表达无明显改变。与PFD+NC组相比,PFD+OE组中Arg-1和CD206的表达均显著降低。结论PFD可以通过下调Cx43促进小鼠RAW264.7巨噬细胞向M2型极化。通过Gap19和过表达慢病毒调节Cx43的表达,也可调节巨噬细胞M2型极化。

暖心康通过“代谢-炎症”网络调控巨噬细胞极化对心肌梗死后小鼠心室重构的影响

目的探究暖心康(红参、毛冬青)通过“代谢-炎症”网络调控巨噬细胞极化改善心肌梗死后小鼠心室重构的作用机制。方法(1)将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组:假手术组、模型组、暖心康组(1.65 g·kg^(-1)),每组10只;采用左前降支冠状动脉结扎术复制心肌梗死小鼠模型;灌胃给药,每日1次,连续4周。采用Masson染色法检测心肌组织胶原沉积情况;超声检测小鼠心功能:左室射血分数(LVEF)、收缩末期左室前壁厚度(LVAWS)及舒张末期左室前壁厚度(LVAWD);流式细胞术检测小鼠心脏巨噬细胞分布情况;qPCR法检测心脏组织乳酸脱氢酶A(LDHA)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、琥珀酸脱氢酶(SDHa)mRNA表达。(2)按照1.15 g·kg^(-1)剂量给予大鼠暖心康混悬液灌胃,每日2次,持续5 d,制备暖心康含药血清。采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞构建促炎型巨噬细胞模型。细胞分组:空白血清对照组(含5%空白血清+5%胎牛血清的培养基)、暖心康含药血清组(含5%暖心康含药血清+5%胎牛血清的培养基)、脂多糖组(含5%空白血清+5%胎牛血清的培养基+200μg·mL^(-1)脂多糖)、暖心康含药血清+脂多糖组(含5%暖心康含药血清+5%胎牛血清的培养基+200μg·mL^(-1)脂多糖),干预16 h。采用糖酵解压力测试实验检测RAW 264.7细胞糖酵解水平;qPCR法检测RAW 264.7细胞线粒体丙酮酸转运载体(MPC1)mRNA表达;MitoSox Red荧光染色法检测RAW 264.7细胞线粒体氧化应激损伤程度。结果(1)与假手术组比较,模型组小鼠的心脏胶原纤维蓝染面积明显增加,并伴有室壁变薄,左心室腔增大;LVEF、LVAWS、LVAWD等心功能指标水平均显著降低(P<0.01,P<0.001);小鼠心脏组织中LDHA、CPT-1 mRNA表达明显上调(P<0.05),GLUT4、IDH、SDHa mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01),CD86染色阳性细胞数量显著增加(P<0.001)。与模型组比较,暖心康组小鼠的心脏胶原纤维沉积明显减少,且室壁厚度增加;LVEF、LVAWS、LVAWD等心功能指标水平均显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001);小鼠心脏组织中LDHA、CPT-1 mRNA表达显著下调(P<0.01,P<0.001),GLUT4、SDHa、IDH mRNA表达显著上调(P<0.01),CD86阳性细胞数量显著减少(P<0.001)。(2)与空白血清对照组比较,暖心康含药血清组巨噬细胞的糖酵解水平、ROS水平均无明显变化(P>0.05),而脂多糖组巨噬细胞的糖酵解水平、ROS水平均显著升高(P<0.01),MPC1 mRNA表达显著下调(P<0.001)。与脂多糖组比较,暖心康含药血清+脂多糖组的巨噬细胞糖酵解水平、ROS水平均显著降低(P<0.05,P<0.01),MPC1 mRNA表达显著上调(P<0.001)。结论暖心康能够减轻小鼠心肌梗死后的心肌纤维化及心室重构,改善心功能,其作用机制可能与下调心脏组织LDHA mRNA表达,上调GLUT4 mRNA表达,改善心肌梗死后心脏葡萄糖摄取能力,抑制促炎型巨噬细胞糖酵解,增加SDHa及IDH的表达以减轻琥珀酸与柠檬酸堆积,减少活性氧(ROS)生成,从而减少促炎型巨噬细胞过度极化有关。

氢吗啡酮对脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞高尔基体应激影响

目的探讨氢吗啡酮(HM)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞高尔基体应激的影响及其机制。方法以10mg/LLPS处理小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S,构建肺泡巨噬细胞高尔基体应激模型。将细胞随机分为Control组(A组,正常培养)、LPS组(B组,给予10mg/L的LPS)、LPS+HM组(C组,给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)、Nrf2siRNA+LPS+HM组(D组,Nrf2siRNA转染后给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)和NC siRNA+LPS+HM组(E组,NCsiRNA转染后给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)。采用ELISA法检测细胞上清液白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)含量;检测丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Westernblot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、高尔基体基质蛋白130(GM130)、高尔基体蛋白97(Golgin-97)、甘露糖苷酶Ⅱ(MannosidaseⅡ)、钙转运ATP酶2C型成员1(ATP2C1)蛋白表达水平;透射电镜下观察细胞高尔基体形态学改变。结果与A组比较,B组IL-1β、IL-6、MDA含量显著升高及Nrf2、HO-1蛋白表达上调,SOD活性显著降低及GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白的表达下调(F=2.33~47.61,P<0.05);与B组比较,C组IL-1β、IL-6、MDA含量显著降低,SOD活性显著升高及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白表达上调(P<0.05);与C组比较,D组IL-1β、IL-6、MDA含量显著升高,SOD活性显著降低及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白表达下调(P<0.05)。透射电镜显示,C组细胞高尔基体损伤、空泡化与碎片化较B组减轻;D组细胞高尔基体损伤、空泡化与碎片化较C组加重。结论HM通过调控Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞高尔基体应激,减轻细胞炎症与氧化应激反应。

绞股蓝多糖提高小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能

研究不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μg/mL)绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino]多糖(GPP)对小鼠腹腔巨噬细胞的影响,探讨GPP对机体免疫功能的调节作用及其可能的作用机制。采用中性红法、Griess法、CCK8法、ELISA法和荧光定量PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、增殖、细胞因子(NO、LDH、TNF-α、IL-1β)的分泌量、CaM和GSα基因的表达水平。结果表明,GPP激活小鼠腹腔巨噬细胞,随着GPP浓度的增加小鼠腹腔巨噬细胞增殖能力增强,当GPP浓度为50.0、100.0、200.0μg/mL时,吸光度与空白对照处理相比差异显著;GPP刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,吞噬能力强于空白对照处理,GPP浓度为200.0μg/mL时,小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力最强;GPP促进小鼠腹腔巨噬细胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌;GPP上调CaM和GSα基因的表达,GPP浓度为100.0、25.0μg/mL时CaM、GSα基因表达量分别达到最高。

TEAD1在小鼠急性心肌梗死后心肌组织巨噬细胞中的表达

目的观察TEA转录因子1(TEAD1)在小鼠急性心肌梗死(AMI)后心肌组织中的表达情况及细胞定位,探讨TEAD1在急性心肌梗死后作用及相关机制。方法取40只6周龄C57BL/6小鼠随机分为急性心肌梗死组(AMI组)和假手术组(Sham组),术后以普通饲料喂养至1、3、7、14天分别处死并取材。本研究以HE染色及Masson染色观察急性心肌梗死后心肌组织的病理改变;免疫组化检测转录因子TEAD1和巨噬细胞标志物CD68在急性心肌梗死后小鼠心肌组织中的表达情况;免疫荧光双标法观察TEAD1在急性心肌梗死后心肌组织中是否在巨噬细胞中高表达。结果免疫组化结果显示,与Sham组相比,AMI组的TEAD1和CD68表达量显著增加(P<0.05),且主要在梗死交界区。AMI组中,TEAD1和CD68表达量随时间呈现先增加后减少的趋势,并在第3天达峰值,且相邻时间点间两者表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光双标结果显示,AMI组巨噬细胞中TEAD1高表达,且除第14天外,相比于Sham组,AMI组表达TEAD1的巨噬细胞数量明显增加(P<0.05),并呈现先增加后减少的趋势,以第3天最多,相邻各时间点数量差异有统计学意义(P<0.05)。结论TEAD1和巨噬细胞标志物CD68在急性心肌梗死后心肌组织中高表达,且TEAD1可以定位在梗死交界区的巨噬细胞中。

芒果苷抑制脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的机制研究

【目的】探究芒果苷抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症反应作用机制,为筛选治疗脓毒症的候选药物提供科学依据。【方法】选取小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)为研究对象,通过CCK-8试剂检测芒果苷对MH-S细胞的毒性作用,根据细胞毒性试验确定芒果苷的作用浓度为100μg/mL,以正常培养的MH-S细胞为对照,使用10μg/mL LPS处理24 h构建体外炎症模型(LPS组),再以100μg/mL芒果苷干预24 h(干预组);通过ELISA检测MH-S细胞上清液中的炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18)含量,采用实时荧光定量PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因表达情况,并以Western blotting和免疫荧光法检测TLR4/NF-κB信号通路的变化。【结果】芒果苷浓度低于287.60μg/mL时,对MH-S细胞无明显的毒性作用。与对照组相比,LPS组MH-S细胞中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因相对表达量极显著升高(P<0.01,下同),细胞上清液中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18含量显著(P<0.05,下同)或极显著升高;但以芒果苷干预后,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因的相对表达量及其分泌水平均显著降低,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞的炎症反应。此外,LPS组MH-S细胞中的NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平极显著高于对照组,经芒果苷干预后NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平均显著下降,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞中核转录因子的表达;LPS组MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显升高,但经芒果苷干预后MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显降低,说明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞表面TLR4的表达。【结论】芒果苷对MH-S细胞的增殖无明显抑制作用,其半数增殖抑制率(IC50)为287.60μg/mL;芒果苷对LPS诱导的MH-S细胞炎症反应具有良好的保护作用,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活而减少炎症因子的分泌有关。

水芹多糖的提取及其对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的初步研究

多糖是水芹中重要功能性成分,其分离和活性的相关研究尚未报道。该研究基于超声波辅助法从水芹中成功分离获得功能性多糖成分——水芹多糖(Oenanthe javanica polysaccharide,OJP),利用响应面法优化了OJP的分离条件,并考察了OJP对巨噬细胞RAW264.7的激活作用。响应面优化结果显示,OJP最佳分离条件为超声温度83.6℃、超声时间51 min、料液比1∶29.7(g∶mL),提取率为13.81%。单糖组成结果显示OJP由阿拉伯糖(29.94%)、半乳糖(52.48%)、葡萄糖(11.32%)以及微量木糖(2.22%)、半乳糖醛酸(3.5%)和葡萄糖醛酸(0.53%)组成。细胞实验结果表明,OJP可促进RAW264.7巨噬细胞增殖及NO产生并增强RAW264.7细胞的吞噬能力。该研究为OJP的开发与应用提供了实验基础。

靛蓝对白细胞介素4诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响

【目的】探讨靛蓝对白细胞介素4(IL-4)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)极化的影响。【方法】建立IL-4诱导的RAW264.7巨噬细胞M2极化模型,分别用0.4、4、40μmol·L^(-1)的靛蓝干预细胞3 d后,采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测精氨酸酶1(Arg-1)、白细胞介素10(IL-10)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及Arg-1的mRNA表达水平。【结果】经0.4、4、40μmol·L^(-1)靛蓝干预后,IL-4诱导的细胞Arg-1的转录水平及Arg-1、IL-10的表达水平均升高,iNOS的转录水平及TNF-α的表达水平均降低。【结论】靛蓝可促进RAW264.7巨噬细胞M2极化并起抗炎作用。

狼毒大戟提取物对结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞的免疫机制研究

目的研究狼毒大戟提取物(狼毒乙素)在结核分枝杆菌(M.tb)感染巨噬细胞中的作用及免疫机制。方法建立结核分枝杆菌H37Ra感染巨噬细胞模型,并用4%台盼蓝检测M.tb感染巨噬细胞后的活性进行检测,用不同浓度的狼毒乙素(0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、12.5μg/ml)干预模型,利用Lyso-Tracker Red染色检测巨噬细胞内溶酶体发生的酸性变化;采用TNF-α和IL-6酶联免疫吸附试剂盒检测细胞因子的分泌状况。结果Lyso-Tracker Red染色结果显示,狼毒乙素能促进自噬体产生,使溶酶体的正常酸化程度增强,从而提高RAW264.7巨噬细胞的自噬能力。与空白对照组相比,在狼毒乙素干预下,炎性细胞因子TNF-α和IL-6受到抑制,并且呈剂量相关性(P<0.05);随着狼毒乙素的浓度增加,细胞因子的分泌受到抑制程度也增大,差异有统计学意义(P<0.05)。结论狼毒乙素通过诱导RAW264.7巨噬细胞的自噬,来增强RAW264.7巨噬细胞清除M.tb的能力。狼毒乙素能够降低炎性细胞因子的水平,且与剂量成明显负相关,说明狼毒乙素具有抗炎作用,可以减弱炎症细胞因子的释放。

丹皮酚通过TLR4/MAPK/NF-κB通路对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用

目的:探讨丹皮酚对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞炎症损伤的保护作用及其机制研究。方法:培养巨噬细胞RAW264.7,并分成空白组、LPS(1μg/mL)组、丹皮酚(240μmol/mL)组和TAK242(10μmol/mL)组。采用CCK8法检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态,比色法测定细胞培养液中GSH、MDA含量,JC-1法检测线粒体膜电位,免疫荧光法检测F4/80及p-NF-κB蛋白表达分布,Western blotting检测细胞中TLR4/MAPK/NF-κB相关通路蛋白表达。结果:与空白组比较,1μg/mL LPS诱导的细胞活力为0.4972±0.061(P<0.01),接近半数抑制率。与LPS组比较,240μmol/mL丹皮酚预处理的细胞组下调p-NF-κB蛋白表达最显著(P<0.01),10μmol/mL TAK242预处理细胞组抑制TLR4蛋白表达最显著(P<0.01)。与LPS组比较,丹皮酚组细胞形态有所恢复;降低细胞培养液中MDA含量、增高GSH含量(P<0.01);线粒体膜电位结果中,丹皮酚组红光显著增强,绿光显著减弱(P<0.001);丹皮酚组F4/80及p-NF-κB蛋白表达分布显著降低(P<0.01),并下调了TLR4、p-IκB、p-p38、p-JNK、p-NF-κB蛋白表达(P<0.05)。结论:丹皮酚可改善LPS诱导的RAW264.7细胞炎症损伤,其机制可能与TLR4/MAPK/NF-κB通路相关。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。