小鼠微小病毒(MVM)荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠微小病毒(MVM)荧光定量PCR方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI上发表的MVM(NC_001510)基因组序列,设计引物和探针,建立MVM荧光定量PCR方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM荧光定量PCR方法最佳线性范围为10~9~10~4拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R^2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1株和KRV株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR方法对178份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM荧光定量PCR方法具有特异、灵敏的特点,为MVM的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为10~9~10~4拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。

荧光RAA检测小鼠微小病毒的研究和应用

目的 病毒培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在小鼠微小病毒(minute virus of mice, MVM)的检测方面都存在一定的不足,不能满足目前实验动物饲养机构现场检测MVM病毒的需要,因此探索开发一种新的、简单易用,便于现场检测MVM的检测方法具有重要的意义。方法 根据Genbank公布的MVM序列,对MVM高度保守序列区域Ns1基因设计荧光重组酶介导链替换核酸扩增的引物和探针,建立了一种MVM荧光法重组酶介导链替换核酸扩增技术(Real-time RAA)检测方法,对其特异性、室温储存稳定性、灵敏度及临床样本验证方面与qPCR法进行对比分析。结果 荧光RAA法在39℃20 min内即可检测到MVM病毒特异性扩增曲线;其灵敏度为10 copies/μL;与Reo-3、MHV-1、MHV-3、MHV-A59、MHV-JHM病毒均无交叉反应;检测试剂室温储存20 d无明显的扩增性能下降;分别对15份阳性模拟样品进行荧光RAA法与qPCR法的检测比对,结果显示两种方法的符合率为15/15;对两种方法的相关性进行统计学分析,结果显示相关系数R^(2)=0.85,两种方法具有显著的线性相关性。结论 本研究建立的MVM荧光RAA法,操作简单,特异性强、灵敏度高,能够快速有效地检出临床样本。