山柰酚对TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症及成肌分化的作用

目的探讨山柰酚对TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症及成肌分化的作用。方法采用生长培养基培养C2C12成肌细胞,用山柰酚(10、20、30、40、50、60μmol/L)处理24 h,CCK8法检测细胞活力。10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL IFN-γ与山柰酚(30、50μmol/L)共处理C2C12细胞24 h,RT-qPCR法检测炎性因子mRNA表达。采用分化培养基诱导C2C12细胞肌分化,在分化第5天,加入TNF-α/INF-γ与山柰酚共处理细胞24 h,RT-qPCR法检测生肌调节因子(MRFs)mRNA表达,免疫荧光观察肌管细胞形态,Western blot法检测PI3K/Akt和MAPKs相关功能蛋白表达。结果与刺激组比较,山柰酚组成肌细胞促炎因子(IL-1β、IL-6),α趋化因子(CCL 2~5)、β趋化因子(CCL 9~11)mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01);肌管细胞形态萎缩得到改善,Myogenin、Myf 6 mRNA表达和p-PI3K、p-ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论山柰酚通过降低促炎因子和α、β趋化因子mRNA表达抑制TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症进程;山柰酚促进肌源性分化,其机制可能与上调PI3K和ERK1/2有关。

抑制小鼠成肌细胞O-GlcNAc对其细胞周期和细胞分化的影响

成肌细胞的高效增殖分化对于畜牧业肉产品生产具有重要意义。试验旨在通过特异性抑制剂OSMI-1抑制氧连接的β-N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine glycosylation,O-GlcNAc)修饰检测小鼠成肌细胞系(C2C12)细胞周期和分化。试验以小鼠C2C12细胞为试验对象,设置空白组、DMSO组和OSMI-1/DMSO组,采用Western Blot确定OSMI-1对O-GlcNAc修饰抑制,采用流式细胞术检测细胞周期变化,使用免疫荧光检测肌管分化标志(myosin heavy chain,Myhc)和qRT-PCR检测分化因子(myogenic differentiation,Myod)及Myhc基因表达水平,分析O-GlcNAc对C2C12肌管分化的影响。结果表明:与空白组和DMSO组相比,OSMI-1/DMSO组24 h和48 h显著抑制了C2C12的O-GlcNAc修饰水平,其细胞周期G2细胞比例显著下降(P<0.05);分化过程中抑制O-GlcNAc修饰水平,免疫荧光显示C2C12分化标志Myhc表达减少,Myod和Myhc的转录和翻译水平显著下降(P<0.05)。说明低水平O-GlcNAc修饰抑制C2C12细胞的细胞周期和细胞分化。

过表达热激蛋白70促进C2C12细胞糖酵解相关基因表达

本文旨在研究热激蛋白70(70-kD heat shock proteins,Hsp70)过表达对C2C12细胞成肌成脂状态下糖酵解的影响。本文以C2C12细胞为研究材料,采用腺病毒过表达Hsp 70基因,通过荧光定量PCR技术和Western印迹技术检测糖酵解基因的表达变化。研究表明,在C2C12细胞成肌分化的过程中,Hsp 70基因与Gsk3β、Pkm、Prkag3、Pfkm和Hk-2基因表达趋势基本一致,推测Hsp70在成肌分化过程中与糖酵解途径有关。细胞过表达Hsp 70在成肌分化后期能显著上调Gsk3β、Pkm、Prkag 3和Pfkm基因的表达(P<0.05),对Hk-2基因的表达未见显著影响(P>0.05)。C2C12细胞成脂诱导过程中,Hsp 70基因与Gsk3β、Pkm、Prkag3、Pfkm和Hk-2基因表达趋势基本一致,推测Hsp70在成脂诱导过程中与糖酵解途径有关。过表达Hsp 70时,C2C12细胞成脂诱导中后期,脂滴数量明显高于对照组,Gsk3β、Pkm、Prkag 3和Pfkm基因的表达显著上调(P<0.05),Hk-2基因的表达未见显著影响(P>0.05)。综上所述,Hsp70在C2C12细胞成肌成脂状态下,通过促进糖原分解为6-磷酸葡萄糖,从而加强糖酵解途径,为Hsp 70基因对C2C12细胞糖酵解的功能研究提供参考。

绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响

目的研究发现,绞股蓝皂苷不仅具有抗炎、抗衰老等多重作用,而且还能促进成骨细胞增殖分化,保护其氧化应激损伤;本研究拟探讨绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响。方法完全培养基培养C2C12细胞,细胞增殖贴壁后用含有不同浓度绞股蓝皂苷的分化培养基诱导细胞分化,每个浓度均设置3个复孔;第5天观察细胞分化的形态、计算细胞的分化活力,Western blot检测相关成肌标志物MYF5和MyoD1的表达,免疫荧光检测MyoD1的表达,Image J软件计算肌管融合指数。结果诱导C2C12细胞分化的第5天可见细胞分化为典型的肌管形态,10 mg/L和5 mg/L的绞股蓝皂苷浓度干预下的MYF5和MyoD1的表达较为显著,且肌管融合指数更高,相较于对照组差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论绞股蓝皂苷可促进C2C12细胞的成肌分化,以10 mg/L和5 mg/L的浓度较好。

激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程.然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究.为了观察Sonic hedgehog(Shh)信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad-Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况.结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.

基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应

肌肉有执行机体运动和能量代谢的重要作用。据报道二噁英暴露可严重影响肌肉发育。但目前与多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)结构相似的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles,PHCZs)的肌肉发育毒性尚不明确。本研究旨在探究2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo-9H-carbazole,27-BCZ)的肌肉发育毒性效应。应用C2C12细胞成肌分化模型,在细胞水平上通过苏木素-伊红染色法检测融合指数和单条肌管内细胞核数2个指标评价细胞形态的变化,在分子水平上通过qRT-PCR来测定肌细胞分化调节分子和分化标志物的基因表达,探究27-BCZ对肌发育的影响及其分子机制。细胞水平实验结果显示,与对照组相比,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)暴露3 d后,肌管数量减少、形态变细变短,且分布杂乱;单条肌管内细胞核数减少、参与肌管融合的细胞核比例(融合指数)降低;27-BCZ 10^(-9)~10^(-7) mol·L^(-1)暴露6 d后,虽然单条肌管内细胞核数没有显著变化,但融合指数显著降低。分子水平实验结果显示,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)在分化末期对肌纤维结构蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的2个编码基因Myh3和Myh4的表达具有显著抑制作用。另外,27-BCZ还影响肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)基因的表达,包括显著抑制分化早期调节因子MyoD和末期调节因子Mrf4的mRNA表达,显著促进Myogenin mRNA表达。此外,27-BCZ暴露能显著促进芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路下游基因cyp1a1和cyp1b1的mRNA表达,提示27-BCZ在肌分化模型中具有类二噁英活性。总结上述结果,我们发现,在肌生成过程中,27-BCZ表现出与二噁英类似的AhR活性和肌发育干扰效应,为27-BCZ肌肉发育相关健康效应和AhR相关毒理机制研究提供了基础数据。

鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响

研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1(UCP1)基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度(0、5、20、50和100μg/mL)鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5(Myf5)、生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、生肌调节因子4(MRF4)的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6 d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度。用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6 d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2 d细胞的活力。结果发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加(P<0.05);血清鞘磷脂含量差异不显著(P>0.05);不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响(P>0.05);成肌分化6 d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因Myf5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调(P<0.01);与未添加鞘磷脂的对照组相比,20μg/mL鞘磷脂组有更多肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加(P<0.05),Myogenin、MRF4基因的表达量显著提高(P<0.05)。利用20μg/mL鞘磷脂诱导细胞分化,在分化2 d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组(P<0.05),细胞活力也显著高于对照组(P<0.05);分化6 d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组(P<0.05)。本研究结果表明,20μg/mL鞘磷脂能够提高小鼠肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考。

miR-127-3p对C2C12细胞成肌分化和转录组的影响

前期研究表明,miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调控,但对于miR-127-3p调控的靶基因及其在成肌分化中的作用还不清楚。应用qRT-PCR与细胞形态学方法研究过表达miR-127-3p对C2C12成肌细胞分化及成肌标志基因MyoD、MyoG和Myosin表达的影响;RNA-Seq分析过表达miR-127-3p对成肌细胞转录组的影响,鉴定差异表达基因并对其功能进行初步研究。结果表明,过表达miR-127-3p显著促进C2C12细胞的成肌分化与MyoD、MyoG和Myosin表达;RNA-Seq分析共鉴定到3个差异基因,均为下调基因,其中包括2个转录因子(Irf7和Ddit3)。GO与KEGG分析显示,这些差异基因显著富集于免疫和能量代谢过程/信号通路。生物信息学分析发现,miR-127-3p可与Ddit3基因的CDS区发生碱基互补配对,进而抑制其表达。表明在转录组水平上,miR-127-3p可能通过直接靶向Ddit3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达,进而调节成肌细胞分化。

干扰Sirt2促进C2C12成肌细胞分化

Sirt2是组蛋白去乙酰化酶(HDAC III)家族成员之一,对细胞周期、自噬、脂肪细胞分化、神经细胞存活等生物学过程的调节发挥重要作用.目前,Sirt2在肌肉发育过程中的研究尚未见报道.本文通过构建Sirt2慢病毒干扰载体,侵染C2C12成肌细胞,并用细胞免疫荧光化学、real-time PCR和Western印迹方法,检测其对成肌分化标志基因及相关信号通路因子的影响.结果显示,干扰质粒shRNA-663处理C2C12细胞后,Sirt2 mRNA及蛋白质表达水平与对照相比显著下调(P<0.01);C2C12细胞分化第4 d,MyoD,MyoG,MyHC mRNA及蛋白质表达均显著增加(P<0.01);PI3K,AKT,FoxO1磷酸化水平明显升高.结果表明,Sirt2可通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路来促进成肌细胞分化,是肌生成的一个潜在调节因子.

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA(microRNAs)分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点;建立了以DNA/LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台;与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大。

中胚叶叉头-1在骨成形蛋白-2诱导肌胚细胞C2C12转化成骨细胞过程中的作用

为了研究中胚叶叉头 1(MFH 1)基因在骨骼形成和细胞分化中的作用 ,利用基因重组、杂交瘤技术制作MFH 1单克隆抗体 ,利用蛋白质印迹和RNA印迹分析观察了骨成形蛋白 2 (BMP 2 )诱导小鼠肌胚细胞C2C12表达MFH 1、产生碱性磷酸酶和骨钙蛋白 .小鼠肌胚细胞C2C12低水平地表达内源性MFH 1蛋白以及导入小鼠MFH 1cDNA的人膀胱癌细胞HTB9也表达小鼠MFH 1蛋白 ,这种蛋白质定位于细胞核中 .用BMP 2处理后 ,MFH 1蛋白和mRNA在C2C12细胞中的表达显著地增加 .用反义MFH 1序列转染小鼠肌胚细胞C2C12可降低内源性MFH 1水平 ,BMP 2不能诱导导入反义MFH 1序列的肌胚细胞C2C12产生MFH 1蛋白 ,也不能诱导碱性磷酸酶 (ALP)活性和骨钙蛋白量的增加 .结果表明 ,BMP 2诱导的MFH 1蛋白在调节肌胚细胞C2C12向成骨细胞分化方面起关键作用 .

Nesprin-1在C_2C_(12)肌原细胞系分化过程中的作用

目的探讨Nesprin-1在肌细胞分化过程中的作用。方法将C2C12肌原细胞分化成肌小管,采用Western blot和免疫荧光技术检测Nesprin-1蛋白表达水平和亚细胞定位在肌小管分化成熟过程中的改变;同时利用RNA干扰技术抑制Nesprin-1蛋白的表达,观察其对C2C12肌原细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在C2C12肌原细胞系分化过程中表达水平以及在细胞中的定位有明显改变。Nesprin-1 siRNA组与对照组相比,分化前后C2C12细胞中Nesprin-1蛋白表达明显降低,同时分化后肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白(myosin)的表达量以及肌小节的数量比对照组均明显减少(P<0.001)。结论本文证实Nesprin-1了对骨胳肌细胞分化至关重要,不同分子大小Nesprin-1亚型在C2C12肌原细胞分化过程中发挥各自的特殊作用,在该细胞质与细胞核中的也有不同的作用。

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族(Semaphorins)成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用此siRNA转染C2C12成肌细胞.通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,realtime qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高.免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低.Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降.进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调.以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs(miRNAs)是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用real-time PCR检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用real-time PCR和Western印迹分别检测成肌因子MyoG和成肌标志基因MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明,miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.

METTL21C下调对小鼠成肌细胞分化的影响

为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P<0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P<0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P<0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。

MiR-106a-5p靶向E2F3和SP-1抑制C2C12细胞成肌分化的研究

为探究miR-106a-5p对成肌分化的作用及潜在调控靶点,在线预测miR-106a-5p潜在靶基因,通过RT-qPCR及Westernblot检测miR-106a-5p对靶基因的调控作用,利用双荧光素酶报告系统验证miR-106a-5p与靶基因之间的互作,并以C2C12细胞系为实验模型,采用过表达技术,在细胞形态学水平初步探索其对成肌分化的作用。在线预测发现E2F3和SP-1可能是miR-106a-5p的潜在靶基因;RT-qPCR分析表明,miR-106a-5p与E2F3和SP-1的表达模式相反;Westernblots结果发现,miR-106a-5p抑制E2F3和SP-1蛋白翻译;双荧光素酶报告载体系统表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p调控成肌分化的靶基因;此外,超表达miR-106a-5p抑制C2C12细胞分化,肌管数目显著减少。结果表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p抑制C2C12细胞成肌分化的靶基因。

Hlcs干扰对C2C12细胞成肌成脂分化后糖酵解基因表达的影响

旨在研究全羧化酶合成酶(holocarboxylasesynthetase,Hlcs)对糖酵解基因表达的影响,为进一步研究细胞糖酵解奠定基础。本试验以C2C12细胞为试验材料,采用siRNA技术干扰Hlcs基因,通过荧光定量PCR和Westernblotting检测Hlcs基因干扰对糖酵解基因表达的影响。结果表明,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与Pfkm、Pkm、Hk-2基因的表达趋势一致,提示Hlcs基因与糖酵解具有相关性。干扰Hlcs后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,糖酵解限速酶Pfkm的mRNA水平显著降低(P<0.05),而显著提高了Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平(P<0.05);生物素作为羧化酶的辅酶,能够显著上调Pkm、Hk-2的mRNA水平(P<0.05)。干扰Hlcs后,细胞分化形成的脂滴数量明显少于对照组,Pfkm的mRNA水平显著升高(P<0.05),且Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);生物素的添加能够显著上调Pfkm、Pkm的mRNA水平(P<0.05)。综上所述,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与糖酵解基因表达趋势一致,且干扰Hlcs基因可以抑制成肌分化C2C12细胞中Pfkm和Hk-2基因的表达,促进Pkm的表达;而促进成脂分化C2C12细胞中Pfkm和Pkm的表达,抑制Hk-2基因的表达。

成肌细胞成脂过程中PPARγ、C/EBPα和Myogenin基因启动子的甲基化变化

【目的】利用C2C12成肌细胞探讨肌源性干细胞成脂过程与调控成脂和成肌分化的关键转录因子PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)、C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein alpha)和Myogenin启动子区甲基化的关系。【方法】分别用2%马血清和三联诱导剂诱导C2C12细胞成肌和成脂分化,在马血清促进的成肌分化第0、1、3和5天收集细胞进行姬姆萨染色观察肌管形成情况;在三联诱导的成脂分化第0、2、4、6和10天收集细胞进行油红O染色观察脂滴形成情况;提取成肌诱导第0、1、3、5天和成脂诱导第0、2、4、6天的RNA和DNA,分别采用qRT-PCR检测成肌和成脂分化相关基因的表达,采用重亚硫酸盐测序的方法检测PPARγ、C/EBPα和Myogenin启动子区甲基化的变化,并分析基因表达与甲基化状态的相关关系。【结果】①C2C12细胞经马血清诱导形成了多核肌管,表达成肌相关基因,但不表达脂肪特异性基因;三联诱导使C2C12细胞自主分化的肌管中沉积了脂滴,同时表达成脂和成肌相关基因;②重亚硫酸盐测序结果表明,在未分化的成肌细胞中,PPARγ基因启动子的甲基化水平是61%,在三联诱导第2、4和6天,其甲基化程度依次为49%、39%和42%,呈逐渐去甲基化趋势,与PPARγ基因转录负相关;在马血清诱导第3和5天,甲基化水平为56%和48%,与未分化的成肌细胞相比差异不显著,同时PPARγ基因的表达水平也没有显著变化;③Myogenin基因在马血清促进的成肌过程中甲基化水平不断降低(49%、42%、35%和34%),转录水平急剧增加;在三联诱导过程中,Myogenin启动子的甲基化水平由0天的49%下降为第1天的37%、第3天的41%和第5天的38%,但下降幅度弱于马血清诱导的成肌过程,这一结果与降低的Myogenin转录上调相吻合;④C/EBPα基因在未分化的C2C12细胞中呈低甲基化状态,甲基化程度仅为1.6%,在成肌分化和脂肪沉积过程中均未发生显著变化,与基因表达无显著关联。【结论】成脂和成肌关键转录因子PPARγ和Myogenin启动子区的DNA甲基化变化参与了成肌细胞的分化和脂肪沉积的调控。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在C2C12细胞中的研究进展

Cas9蛋白(CRISPR相关蛋白9)源自Ⅱ型CRISPR(簇状有规律间隔的短回文重复序列)细菌免疫系统,其正在成为在各种生物体中工程基因组的强大工具.自该技术创立以来,就被广泛用于将供体DNA靶向插入动物基因组.在C2C12细胞中,CRISPR/Cas9系统参与许多方面研究,包括基因特异性敲除/敲入、基因突变载体的构建以及分子作用机制探索.通过阐述C2C12细胞基因编辑方面的研究进展,对CRISPR/Cas9系统在C2C12细胞中基因编辑方面的应用进行了综述,为各种骨骼肌增殖分化研究提供参考.

不同浓度红景天苷对成肌细胞体外分化的影响及机制初探

研究目的:探讨不同浓度红景天苷对成肌细胞株C2C12体外分化的影响及可能机制,有望为成肌细胞增殖分化寻求更有效的外源调控物,以促进成肌细胞的移植和临床应用,同时为进一步开展红景天苷在体内骨骼肌损伤中的作用及机制研究奠定基础。研究方法:研究1:红景天苷对成肌细胞体外分化的影响:1)在C2C12中加入不同浓度红景天苷处理,在诱导成肌分化过程中,应用相差显微镜观察不同浓度红景天苷对C2C12分化过程中汇聚、融合和形成多核肌管的影响;2)应用免疫荧光组化方法,分析不同浓度红景天苷对C2C12成肌分化融合率的影响;3)应用real-time PCR和Western Blotting方法,检测红景天苷对C2C12成肌分化特异基因和蛋白表达的影响;研究2:红景天苷影响成肌细胞体外分化的机制初探:应用Western Blotting方法,检测红景天苷处理后C2C12成肌分化中TGF-β/Smad信号通路的变化。结果:50μg红景天苷处理:研究1:1)光镜观察结果从形态学上显示,红景天苷处理显著抑制C2C12细胞的融合和多核肌管的形成;2)免疫荧光检测结果表明Myosin-neonatal(E-MHC)阳性面积和myogenin阳性核均显著减少(P<0.05),显著抑制C2C12细胞分化过程中肌管形成,促进细胞增殖;3)real-time PCR和Western blotting检测结果表明,成肌分化特异因子MyoD和myogenin基因和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),显著抑制C2C12细胞分化过程中细胞的融合和肌管的形成;研究2:Western blotting检测结果表明,红景天苷显著抑制C2C12细胞分化效应,伴有Smad2/Smad3磷酸化激活增加,尤其是Smad3激活水平显著增加(P<0.01);30μg红景天苷处理作用不显著(P>0.05)。结论:1)红景天苷能显著抑制骨骼肌成肌细胞体外成肌分化,并促进骨骼肌成肌细胞激活增殖,促进卫星细胞库储备增加。2)红景天苷对骨骼肌成肌细胞体外分化增殖的影响存在剂量依赖性,以50μg红景天苷干预能达到显著效果。3)红景天苷可能是通过促进TGF-β/Smad通路的关键介导子Smad2和Smad3(尤其是Smad3)磷酸化来发挥作用。