氟化钠对小鼠成骨细胞中RANKL/OPG mRNA体外表达的影响

为探讨氟化钠对小鼠成骨细胞中核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)mRNA表达比率的影响,选取新生小鼠颅盖骨,用胰蛋白酶-胶原酶消化法分离培养成骨细胞。取其第3代成骨细胞,在实验组培养液中加入不同浓度的氟化钠(10-7、10-6和10-5mol/L),并分别培养24、48、96和144 h,从细胞板贴壁细胞中提取总RNA,应用荧光定量RT-PCR方法检测细胞中RANKL与OPG mRNA表达比率的变化。结果显示,氟化钠增加了RANKL/OPG mRNA的表达比率,且呈明显的时间剂量效应关系。对照组和实验组在培养48 h时,RANKL与OPGmRNA的表达比率显著增加(P<0.01)。本实验浓度的氟化钠能够增加小鼠颅盖骨成骨细胞中RANKL/OPG mRNA的表达比率。

山竹壳提取物对小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的研究山竹壳提取物对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1增殖和分化的影响。方法采用活性追踪的方法,用不同终质量浓度的山竹壳提取物和D101大孔树脂柱层析样品溶液进行干预,分别以MTT法和细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测法评价各样品对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响;用试管反应方法鉴别活性部位的主要化学成分类型,再按照2010版《中国药典》附录XB法测定活性部位的鞣质含量。结果山竹壳水溶性成分有一定的促MC3T3-E1细胞增殖和分化的作用,而脂溶性成分具有显著的细胞毒性;水溶性成分经D101大孔树脂柱层析的70%乙醇洗脱部位（SZ-S7）在12.5~50.0 mg/L范围内培养24、48、72 h时均可显著促进MC3T3-E1细胞增殖,培养3、5、7 d时均能显著促进MC3T3-E1细胞内ALP的形成,且其作用明显优于其它洗脱部位;化学成分分析表明,SZ-S7主要为缩合鞣质,总缩合鞣质含量达87.8%。结论山竹壳水溶性成分具有促进小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1的增殖和分化的作用,且经D101大孔树脂柱层析的70%乙醇洗脱部位为主要活性部位,可能对预防和治疗骨质疏松有一定的作用。

褪黑素拮抗高糖导致的小鼠成骨细胞凋亡作用研究

目的:探讨褪黑素对高糖诱导成骨细胞凋亡的保护作用及作用机理。方法:小鼠成骨细胞株(MC3T3-E1)贴壁培养后,分成三组:对照组,高糖组,高糖+褪黑素组。采用MTT方法检测小鼠成骨细胞增殖情况,采用TUNEL、Western-blot、流式细胞术等方法检测MC3T3-E1凋亡,采用Western-blot测定PI3K/AKT通路相关蛋白水平。结果:高糖可以抑制成骨细胞增殖,高糖作用24、48h的半数抑制浓度分别是49.3mmol/L和36.7mmol/L。高糖诱导细胞凋亡增加。40mmol/L高糖作用细胞48h,细胞的凋亡达到了40.8%,凋亡相关蛋白表达也增加。而褪黑素可以激活PI3K/AKT保护通路,明显拮抗高糖诱导的成骨细胞凋亡。30μmol/L褪黑素可以使高糖(40mmol/L)诱导的凋亡率从40.8%降低到28.3%。凋亡相关蛋白表达减低。结论:褪黑素通过上调PI3K/AKT通路表达,拮抗高糖诱导的成骨细胞的凋亡。

芹菜素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响

目的探讨芹菜素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。方法分别采用MTT法、碱性磷酸酶活性、茜素红染色测定不同浓度芹菜素对MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化、矿化作用的影响。结果芹菜素在5～100μmol/L浓度范围内对MC3T3-E1细胞增殖无显著影响,在10～100μmol/L浓度范围内能显著增加MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性（P〈0.01）以及促进其矿化作用。结论芹菜素可促进MC3T3-E1细胞成骨分化和矿化。

持续激活β-连环蛋白对小鼠成骨细胞增殖和凋亡的影响

目的观察持续激活β-连环蛋白(β-catenin)对小鼠成骨细胞增殖和凋亡的影响。方法新生3 d基因型为3.2 kb-Cre;β-catentin exon 3 FX+/+小鼠及野生型(WT)小鼠各20只分别作为CA-β-catenin组和对照组,2组均腹腔注射他莫昔芬(TM)以持续激活β-catenin(CA-β-catenin)。持续激活1个月后分离培养小鼠原代成骨细胞,并进行形态观察,收集胫骨标本行增殖(Brdu)染色,TUNEL凋亡染色,细胞周期相关因子(c-myc、cyclin Y)的免疫组化实验。结果与对照组小鼠相比,CA-β-catenin组小鼠成骨细胞增殖增多,凋亡减少,差异有极显著性统计学意义(P<0.01);CA-β-catenin组G1期关键调节因子c-myc、G2期调节因子cyclin Y表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论持续激活β-catenin可使小鼠成骨细胞增殖增多、凋亡减少,一直处于高增殖状态。

三七粗多糖的分离纯化及其对人牙周膜干细胞、小鼠成骨细胞体外增殖活性的影响

目的从工业三七药渣中提取、分离及纯化三七多糖,测定三七粗多糖及三七多糖洗脱组分的含量、分子量和p H,并考察其对人牙周膜干细胞、小鼠成骨细胞体外增殖活性的影响。方法以提取过三七总皂苷的工业三七药渣为原料,采用水提醇沉法得到三七粗多糖,通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离纯化三七粗多糖;采用蒽酮-硫酸法测定三七粗多糖及三七多糖洗脱组分的含量,用高效凝胶渗透色谱法测定其分子量;采用MTT法测定三七粗多糖及三七多糖洗脱组分对人牙周膜干细胞、小鼠成骨细胞体外增殖活性的影响。结果水提醇沉法得到三七粗多糖的含量为69. 7%,得率2. 43%;通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离纯化三七粗多糖,得到水洗脱部分PNPSⅠ及Na Cl溶液梯度洗脱部分PNPSⅡ~Ⅴ;三七粗多糖、PNPSⅠ~Ⅴ重均分子量分别为38. 59、32. 00、96. 98、148. 60、154. 40、113. 60 k Da;在一定浓度范围内,三七粗多糖、PNPSⅠ~Ⅱ能促进人牙周膜干细胞的生长,PNPSⅢ~Ⅳ能抑制其生长;三七粗多糖、PNPSⅠ~Ⅳ具促进小鼠成骨细胞生长的作用。结论通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离纯化三七粗多糖,得到1种中性多糖和4种酸性多糖;三七粗多糖、PNPSⅠ~Ⅱ能促进人牙周膜干细胞的体外增殖,三七粗多糖、PNPSⅠ~Ⅳ具促进小鼠成骨细胞生长的作用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠成骨细胞Pax1表达的影响

目的探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对小鼠成骨细胞骨骼发育相关基因Pax1表达的影响。方法麻醉后取胎鼠的顶骨,采用改良的组织块培养法体外培养小鼠成骨细胞,碱性磷酸酶法鉴定成骨细胞,将浓度为100、200、500、1000和1500mg/L的DON分别作用于对数生长期的成骨细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测DON对成骨细胞增殖的作用。半定量RT-PCR和Western blotting检测不同剂量DON对体外培养小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达的影响。结果培养的细胞鉴定为成骨细胞,不同浓度DON能降低小鼠成骨细胞的增殖速度,并可增加小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达,随着DON浓度增加,小鼠成骨细胞Pax1基因表达增多越显著。结论 DON促进小鼠成骨细胞Pax1基因的表达,进而影响骨骼的发育。

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞增殖活性及细胞周期影响的实验研究

目的:观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)增殖活性及细胞周期变化的影响,探讨该方剂治疗牙周炎的作用机理。方法:MC3T3-E1细胞分别于5%、10%、15%、20%补肾活血固齿方含药血清,10%无药血清,10%胎牛血清中培养12、24、36、48、60、72 h,MTT法检测补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响。另外MC3T3-E1细胞分别于10%补肾活血固齿方含药血清、无药血清、胎牛血清中培养24、48、72 h,用流式细胞仪检测该方剂对MC3T3-E1细胞细胞周期的影响。结果:含药血清与胎牛血清、无药血清组相比,MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期差异无显著性(P>0.05)。结论:补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期无影响,其可能是通过促进该细胞向成骨细胞分化、促进牙槽骨的再生而发挥药物作用。

间歇性高糖环境对小鼠颅骨成骨细胞的影响

目的:观察间歇性高糖环境对小鼠颅骨成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的影响。方法:将体外培养原代小鼠颅骨成骨细胞分为3组:正常糖浓度组(5.5mmol/L GLU)、持续性高糖组(25mmol/L GLU)、间歇性高糖组(5.5mmol/L GLU^25mmol/L GLU),干预3天后,MTT法检测细胞增殖抑制率;干预3周后,比色法和放射免疫法(RIA)分别检测培养上清液中碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)水平的变化。结果:(1)在相同干预时间点,与正常糖浓度组相比,高糖组细胞增殖受抑制,其中间歇性高糖组细胞受抑制更显著(P<0.05)。(2)在相同干预时间点,高糖组成骨细胞的ALP、OCN均较正常糖浓度组下降,其中间歇性高糖组下降更显著;(3)随干预时间增加,高糖组成骨细胞的ALP、OCN均较正常糖浓度组下降(P<0.05)。结论:高糖环境可抑制成骨细胞的增殖、诱发细胞凋亡,并导致功能蛋白ALP、OCN下降,且这一损害作用在间歇性高糖环境更为显著。

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹(Western blotting)检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶(ALP)染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物(miR-103-3p mimics)及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因m RNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制(P<0.05),Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。

二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞增殖和分化的影响

目的 :探讨低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、成骨分化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:将MC3T3-E1细胞接种到培养板24h后,实验组培养基中分别加入50μM(50μM组)和200μM(200μM组)的DMOG,对照组加入完全培养液。分别于培养1、3、5d时采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,5、10d行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测成骨细胞分化,21d用茜素红染色检测MC3T3-E1细胞钙结节的形成并进行定量分析,采用ELISA法检测MC3T3-E1培养3d情况时上清液中的VEGF蛋白含量,并用实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞VEGF mRNA的相对表达量。结果:培养1d时对照组、50μM组和200μM组的MC3T3-E1的光密度(optical density,OD)值分别为0.041±0.009、0.074±0.019、0.086±0.044,3d时分别为0.123±0.027、0.148±0.020、0.224±0.061,5d时分别为0.297±0.044、0.325±0.084、0.354±0.038,1d、3d时50μM组和200μM组与同时间点对照组比较均有显著性差异(P<0.05),3d时50μM组与200μM组有显著性差异(P<0.05)。培养5d和10d时对照组ALP染色颜色较深,50μM组颜色中等,200μM组颜色较浅;5d时对照组ALP活性为1.943±0.072,50μM组为1.632±0.051,200μM组为1.319±0.065;10d时对照组ALP活性为3.734±0.067,50μM组为3.381±0.070,200μM组为2.831±0.086。三组间同时间点比较均有统计学差异(P<0.05),同组10d时与5d时比较均有统计学差异(P<0.05)。茜素红染色200μM组可见少量红色结节,50μM组可见中等量红色结节,对照组可见大量红色结节;对照组茜素红含量(μg/ml)为56.178±7.940,50μM组为41.922±2.438,200μM组为31.929±1.922,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。培养3d时对照组细胞培养上清液中VEGF蛋白含量(ng/孔)为9.063±0.603,50μM组为12.123±0.870,200μM组为15.540±0.581,三组间比较均有统计学差异(P<0.05);50μM组VEGF mRNA表达量为对照组的1.792±0.067,200μM组为对照组的3.963±0.092,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。结论 :低氧模拟剂DMOG可促进MC3T3-E1细胞增殖和VEGF表达,抑制其成骨分化。

人参皂苷Rg1对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化的相关研究

目的:研究人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,简称Rg1)对MC3T3-E1小鼠成骨细胞增值、分化及迁移能力的影响。方法:采用不同浓度人参皂苷Rg1,1×10^(-1)mg/m L、1×10^(-2)mg/m L、1×10^(-3)mg/m L、1×10^(-4)mg/m L、1×10^(-5)mg/m L对MC3T3-E1进行CCK-8细胞增值的影响,采用ALP进行细胞分化的检测。结果:与标准组对比Rg1浓度在1×10^(-3)mg/m L时可明显促进细胞增殖,分化(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1可促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化。

镁离子联合矿化胶原干预小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期研究证实,镁基金属与矿化胶原联合应用在修复极限缺损时具有良好的支撑效果,可在一定程度上改善矿化胶原机械强度过差及在骨愈合期间过早塌陷的问题。然而,镁基金属在含氯化物溶液(包括人体体液或血浆)中降解较快,其中释放镁离子对成骨细胞增殖分化等的影响尚不清楚。目的:分析镁离子联合矿化胶原对小鼠前成骨细胞体外成骨分化能力的影响。方法:分别采用镁离子浓度为0,5,10,20 mmol/L的完全培养基制备矿化胶原浸提液,以4种矿化胶原浸提液培养小鼠前成骨细胞,分别设为矿化胶原组及5,10,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组,以完全培养基培养的小鼠前成骨细胞为空白对照组。观察细胞的形态、增殖、凋亡、细胞内微丝肌动蛋白与成骨诱导分化后的碱性磷酸酶活性及成骨基因Runx2的表达。结果与结论:①培养24 h,矿化胶原组、5,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞贴壁情况良好,与空白对照组无明显差异,细胞形态呈长梭形,表面有多个突触与邻近的细胞相联系;20 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞呈现明显的核浓缩;②培养1,3,5 d时,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞活力高于其余4组(P<0.05),矿化胶原组、5 mmol/L Mg2++矿化胶原组与空白对照组无差异(P>0.05),20 mmol/L Mg2++矿化胶原组低于空白对照组(P<0.05);③培养3 d后DAPI染色显示,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组可见明显细胞核解体的现象,其余4组未见明显细胞核解体;④培养24 h后鬼笔环肽染色显示,除空白对照组、20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组细胞结构完整伸展,肌动蛋白微丝清晰明显,尤以10mmol/LMg2++矿化胶原组最为明显;⑤成骨诱导分化7 d后,除20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组碱性磷酸酶活性与Runx2基因表达均高于空白对照组(P<0.05),且10 mmol/L Mg2++矿化胶原组高于5 mmol/L Mg2++矿化胶原组、矿化胶原组(P<0.05);⑥结果表明,镁离子与矿化胶原联合应用需要在适当的镁离子浓度范围(≤10 mmol/L)下进行。

聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散,使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法:分别制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)上,以单独培养的细胞为空白对照(D组),扫描电镜下观察材料表面的细胞黏附形态,通过CCK-8、碱性磷酸酶活性、酶联免疫吸附实验、RT-PCR与Western blot检测分析3种材料对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,MC3T3-E1细胞在A组复合材料表面黏附数量最多,生长状态良好,细胞拉伸明显,伪足伸出较多,细胞相互连接成网状结构;(2)CCK-8实验显示,与D组相比,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞的增殖(P<0.05),其中以A组复合材料促增殖效果最显著(P<0.05);(3)与D组相比,3种材料均可提升MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶活性(P<0.05),其中以A组提升最显著(P<0.05);(4)酶联免疫吸附实验显示,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素与I型胶原,其中以A组促进作用最显著(P<0.05);(5)RT-PCR检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的m RNA表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(6)Western blot检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的蛋白表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(7)结果表明,聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白与基因的表达,对其成骨分化起积极作用。

3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸对成骨细胞前体增殖和成骨分化的作用

目的观察不同浓度的3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸(3,3',5-triiodo-L-thyronine,T3)对小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)细胞增殖及分化水平的作用.方法分别给予不同浓度T3干预细胞,培养1、2、3 d后采用CCK8法检测细胞增殖水平;在成骨分化诱导试剂干预7 d基础上,结合上述T3给药,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测各浓度组成骨细胞分化水平,通过实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测各浓度组的成骨细胞标记性基因及蛋白的表达差异.结果在分别干预1、2、3 d后,T3随着浓度增高,对细胞的增殖水平均呈明显上调;而且相同剂量的T3对于细胞增殖呈时间依赖性增强.此外,MC3T3-E1 Subclone 14细胞诱导7 d后,对比于0对照组,低浓度T3(1 nmol/L)对成骨细胞各分化参数均无明显作用,而10、100、1000 nmol/L的T3对细胞ALP染色,成骨细胞相关基因及蛋白均明显上调,其中以10和100 nmol/L组最为显著.结论T3对于MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖和成骨细胞分化均有显著的促进作用.

Zfp260对MC3T3-E1细胞体外成骨分化及增殖、迁移影响的实验研究

目的:探究锌指蛋白260(zinc-finger protein 260,Zfp260)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1 cells)体外成骨分化及增殖、迁移的影响。方法:体外培养并诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测诱导7、14 d后Zfp260的表达量变化。用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染MC3T3-E1细胞,并通过RT-qPCR测定Zfp260的敲降效率及敲降组与对照组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)等成骨生物标志物表达量的变化。通过Transwell、细胞划痕实验检测敲降Zfp260后MC3T3-E1细胞迁移能力的变化。通过CCK8实验检测敲降Zfp260后MC3T3-E1细胞增殖能力的变化。结果:体外诱导MC3T3-E1细胞成骨分化后,Zfp260的表达量明显上调(P<0.05)。使用siRNA敲降Zfp260后,ALP及BMP2的表达量明显下调(P<0.05)。Transwell及细胞划痕实验证明敲降Zfp260后,MC3T3-E1细胞的迁移能力受到抑制。CCK8实验证明敲降Zfp260后,MC3T3-E1细胞的增殖能力增加。结论:Zfp260可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P<0.05);DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。

糖基化终末产物刺激下长链非编码RNA H19通过WNT/β-catenin信号通路调控MC3T3细胞骨向分化

目的:探究长链非编码RNA H19(LncRNA H19)在糖基化终末产物(AGEs)刺激下对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的调控作用及其可能的机制。方法:10μg/mL AGEs浓度刺激下培养MC3T3-E1细胞,7 d后碱性磷酸酶染色、21 d后茜素红染色观察细胞矿化情况;RT-PCR检测细胞中ALP、Runx-2、OCN、SP7以及LncRNA H19 mRNA的表达水平,Western blotting检测细胞中Runx-2蛋白表达水平;采用细胞转染技术过表达LncRNA H19,RT-PCR检测LncRNA H19的转染效率;并检测转染LncRNA H19后细胞中骨基因的表达水平、ALP染色情况以及β-catenin的表达情况。结果:AGEs刺激下MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶染色变浅、钙化结节形成减少,ALP、Runx-2、OCN、SP7、LncRNA H19基因表达水平降低(P<0.05),Runx-2蛋白水平表达下降;转染过表达LncRNA H19(lv-H19)后,LncRNA H19表达水平显著上调(P<0.05),ALP、Runx-2、OCN、SP7基因表达水平上升(P<0.05),碱性磷酸酶染色变深,β-catenin的表达增加。结论:AGEs刺激下,LncRNA H19可能通过WNT/β-catenin的表达影响了MC3T3-E1细胞的骨向分化。

载rhPTH(1-34)纳米缓释纤维促成骨作用的体外研究

目的:制备载甲状旁腺相关肽(rhPTH(1-34))的电纺丝缓释纤维,研究其缓释效果及对成骨细胞增殖、分化的影响。方法:制备含rhPTH(1-34)电纺丝缓释纤维(PLLA/rhPTH(1-34)),扫描电镜(SEM)观察其形貌。紫外分光光度法测定释放速率。噻唑蓝法(MTT)测定PLLA/rhPTH(1-34)对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的增值活性,碱性磷酸酶(ALP)测定其分化。结果:含模型药物的电纺丝缓释纤维体外有效释放21d,PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维促进细胞的增殖作用明显(P<0.05),并能显著促进细胞的分化(P<0.05)。结论:PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维可以有效缓释药物,并能促进MC3T3-E1DE增殖、分化。

氟和铝对小鼠胚胎成骨细胞骨保护蛋白和核因子κB受体活化因子配体mRNA表达的影响

目的观察氟和铝对小鼠胚胎成骨细胞株(MC3T3-E1)骨保护蛋白(OPG)和NF-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。方法 在细胞培养液中加入50μmol/L氟化钠或/和5μmol/L氯化铝;72 h后提取细胞总mRNA,用RT-PCR方法分析MC3T3-E1细胞OPG和RANKL的mRNA表达,进行半定量分析。结果与对照组比较,氟铝联合染毒可显著提高MC3T3-E1细胞OPG mRNA的表达(P<0.05),两者具有协同作用(P<0.05),但氟铝联合染毒对MC3T3-E1细胞RANKL mRNA的表达水平无显著改变;因此,与对照组相比,氟铝联合染毒组RANKL/OPG比值显著降低(P<0.05)。结论氟铝联合可能通过增加成骨细胞OPG基因表达水平来抑制破骨细胞的分化和成熟,从而抑制骨吸收,使骨形成大于骨吸收。