小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析

目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。

碳-二氧化硅纳米复合颗粒促进小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的研究

目的研究碳-二氧化硅纳米复合颗粒(carbon-silica nanocomposite,CSN)对M2型小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)极化的影响。方法将介孔二氧化硅纳米复合颗粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN)包覆葡萄糖,再经碳化制备得到CSN。利用红外光谱、能量色散X射线谱、透射电子显微镜和扫描电子显微镜对CSN进行表征;CCK-8实验检测CSN对小鼠BMDM的细胞活性的影响;将小鼠BMDM铺于6孔板,设置M0、M1、M2和M2+CSN组,用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测M1巨噬细胞中CD86、白介素6(interleukin-6,IL-6)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)及M2型巨噬细胞中CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的mRNA表达水平;Western blot检测iNOS和Arg1的蛋白表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞分子标志物CD80和CD206的表达情况。结果CSN由碳、氧和硅元素组成,元素比例分别为36.6%、35.5%和27.9%,呈均匀分散的球形纳米结构,直径分布为80~90nm。CSN在0、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml浓度下对小鼠BMDM的细胞活性影响无明显差异(P>0.05),与M0组比较,M1组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.01),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);M2组CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.001,P<0.01),Arg1蛋白表达升高(P<0.01),CD206表达升高(P<0.001)。与M2组比较,M2+CSN组CD86、IL-6和iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.001),iNOS蛋白表达升高(P<0.05),CD80表达升高(P<0.05);CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05,P<0.001),Arg1蛋白表达降低(P<0.05),CD206表达降低(P<0.05)。结论CSN能促进M2型巨噬细胞向M1型转化,调节肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)中M1/M2比例。

小鼠BMSCs和人源UCMSCs的生物学特性比较研究

目的:通过比较分析小鼠骨髓来源的间充质干细胞(mBMSCs)和人脐带来源的间充质干细胞(hUCMSCs)的生物学共性特征,为选择hUCMSCs作为移植细胞,开展临床前体内药效评价提供理论依据。方法:采用“全骨髓贴壁法”联合“红细胞裂解法”,分离、纯化得到mBMSCs,再与已有的hUCMSCs进行比较,采用荧光倒置显微镜下观察两者的形态学特点,采用cck8法比较两者增殖活性,采用流式细胞术分析两者表面标志物及干性标志物表达。结果:mBMSCs和hUCMSCs的形态特征高度相似,均呈螺旋状贴壁生长,形态均一,多成梭形。但mBMSCs传代至7代以上,则形态开始改变,有分化趋势,而hUCMSCs传至10代以上,仍稳定生长。mBMSCs和hUCMSCs的表面标志物表达高度相似,CD90及CD105表达率均≥95%,CD45及CD34表达率均≤2%。此外,与mBMSCs相比,hUCMSCs展示了更高的体外增殖活性,并且干性标志物Oct-4、Sox2和Nanog的表达量更高,这可能与细胞来源及体外培养条件有关。结论:mBMSCs和hUCMSCs的形态学特征及表面标志物表达有高度相似性,但hUCMSCs体外增殖活性和干性标志物表达量相对较高。该研究为以hUCMSCs作为移植细胞开展临床前体内药效评价提供了部分科学依据。

小鼠骨髓来源巨噬细胞培养模型的建立及鉴定

目的建立小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)培养模型,并对BMDM进行细胞表面标志物及吞噬能力鉴定。方法采用32℃培养10 d和37℃培养3 d的方式培养L929细胞,检测细胞上清中巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的浓度。获取小鼠骨髓细胞后,分别以M-CSF和两种条件培养的L929细胞上清进行诱导分化,通过光学显微镜对诱导分化后的BMDM进行形态学观察;流式细胞术检测CD11b阳性细胞株所占百分比,免疫荧光法观察诱导后巨噬细胞表面标志抗原CD11b和CD16的表达;对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌进行吞噬试验鉴定BMDM的吞噬功能。结果32℃培养10 d的L929细胞上清中M-CSF的浓度显著高于37℃培养3 d(P<0.05)。3种诱导方式均可使小鼠骨髓源细胞分化成熟,经32℃培养10 d的L929细胞上清诱导分化后的BMDM生长状态最佳。流式细胞术检测显示巨噬细胞表面标志抗原CD11b阳性率为80.62%,免疫荧光检测显示诱导分化后的BMDM细胞表面有巨噬细胞标志性抗原CD11b和CD16的表达,且具有对表达绿色荧光蛋白的大肠埃希菌良好的吞噬能力。结论成功制备了小鼠BMDM,并优化了制备和鉴定的条件,为研究免疫细胞功能、病原微生物与巨噬细胞相互作用提供了理想的细胞模型制备方法。

戊型肝炎疫苗评价用小鼠品系的比较

目的比较不同品系及相同品系不同来源BALB/c小鼠对戊型肝炎疫苗(HE疫苗)的免疫应答,探讨适用于HE疫苗评价的小鼠品系,规范疫苗效力评价用动物。方法分别用2家企业制备的HE疫苗免疫BALB/c、C57BL/6、KM和NIH 4种品系小鼠及3种不同公司来源的BALB/c小鼠,均免疫1针,28 d后采血,分离血清,检测抗体应答,计算效力ED_(50)。结果 2家疫苗免疫C57BL/6、KM和NIH小鼠时,各剂量组均表现出敏感应答,提示C57BL/6、KM和NIH小鼠对本研究中的2家疫苗不能灵敏地反映出剂量变化趋势,不适用于HE疫苗效力评价;BALB/c小鼠对2家企业各剂量组HE疫苗均呈现良好的免疫应答,且呈明显的剂量效应关系。3种不同来源的BALB/c小鼠免疫HE疫苗后,抗体应答存在差异。结论 BALB/c小鼠可作为评价HE疫苗免疫原性和效力ED_(50)的模型动物;应用BALB/c小鼠进行疫苗评价时需固定小鼠来源。

源于C57BL/6小鼠的原代破骨细胞氯化钴模拟低氧模型的建立

【目的】探索C57BL/6小鼠骨髓来源的原代破骨细胞氯化钴诱导的低氧模型的建立方法。【方法】提取4~6周龄雄性C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓细胞,通过流式细胞术鉴定单核巨噬细胞(bone marrow-derived mononuclear macrophages,BMMs)表面标记物;BMMs经巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核刺激因子-κB受体配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导4 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察BMMs向原代破骨细胞诱导分化情况;利用MTT法确定氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟原代破骨细胞低氧浓度;运用Western blotting技术检测原代破骨细胞低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达量。【结果】BMMs簇分化抗原11b(cluster differentiation 11b,CD11b)呈强阳性,阳性率为97.90%;BMMs经过M-CSF和RANKL诱导后,产生了大量破骨细胞,TRAP染色为阳性;MTT和Western blotting技术确定原代破骨细胞CoCl2模拟低氧最相似浓度为50μmol/L。【结论】本研究成功地将BMMs诱导分化为破骨细胞,采用50μmol/L的CoCl2可建立该原代破骨细胞的低氧模型。

替格瑞洛体外抗炎活性及机制研究

探讨替格瑞洛对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)构建NLRP3炎症小体抗炎活性的影响。LPS诱导HUVECs体外炎症模型,ELISA试剂法检测替格瑞洛对炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表达情况;LPS+尼日利亚菌素(nigericin)诱导BMDMs NLRP3炎症小体,ELISA试剂法和Western Blot法检测炎症小体激活情况;诱导BMDMs NLRP3炎症小体前后分别给予不同浓度替格瑞洛干预,ELISA试剂法和Western Blot法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、Caspase-1表达情况;LPS诱导小鼠脓毒血症模型,替格瑞洛干预治疗,ELISA试剂法检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子表达情况。结果:1.LPS诱导HUVECs炎症模型呈浓度依赖性,随浓度的增加,细胞活性逐渐降低;中间质量浓度100、200 ng/mL诱导效率最高,随诱导时间增加,细胞活性稍增加或基本不变。2.不同浓度的替格瑞洛作用于LPS诱导的HUVECs炎症细胞模型中,均能下调TNF-α、IL-6、IFN-1β炎症因子,上调IL-10炎症因子水平,且炎症因子水平变化均呈现剂量浓度依赖趋势。3.炎症小体激活前、后进行药物干预,均能抑制炎症因子Caspase-1和IL-1β的表达,并且其抑制程度呈剂量依赖性;而激活前药物干预,TNF-α的表达量下降;激活后药物干预,TNF-α的表达量则基本不变。4.LPS诱导小鼠脓毒血症,替格瑞洛治疗组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低。替格瑞洛在体外HUVECs细胞试验中,具有明显的抗炎活性;通过构建小鼠BMDMs炎症小体,研究替格瑞洛在免疫细胞上对炎症的调控作用,发现其可以作用于NLRP3炎症小体活化的启动阶段,抑制NF-κB信号通路的激活,阻止炎症反应的继续。